Une phosphatase lipidique MTMR conservée supprime de plus en plus l'autophagie dans les neurones du cerveau au cours du vieillissement

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 21817 (2022) Citer cet article

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Le vieillissement est entraîné par l'accumulation progressive, tout au long de la vie, de dommages cellulaires. L'autophagie (auto-alimentation cellulaire) fonctionne comme un mécanisme majeur de clairance cellulaire pour dégrader ces dommages, et sa capacité diminue avec l'âge. Malgré son importance physiologique et médicale, on ne sait toujours pas pourquoi l'autophagie devient incapable d'éliminer efficacement les matériaux cellulaires nocifs dans de nombreuses cellules à un âge avancé. Ici, nous montrons que les défauts associés à l'âge dans la dégradation autophagique se produisent aux stades précoce et tardif du processus. De plus, chez la mouche des fruits Drosophila melanogaster, la tyrosine phosphatase dérivée de l'œuf (EDTP), lipide phosphatase liée à la myotubularine (MTMR), connue sous le nom de répresseur de l'autophagie, s'accumule progressivement dans les neurones du cerveau au cours de la vie adulte. L'augmentation de l'activité EDTP liée à l'âge est associée à une méthylation croissante de l'ADN N6-adénine au locus EDTP. Le MTMR14, l'homologue humain de l'EDTP, a également tendance à s'accumuler avec l'âge dans les neurones du cerveau. Ainsi, l'EDTP, et vraisemblablement le MTMR14, favorise le vieillissement cérébral en supprimant de plus en plus l'autophagie tout au long de l'âge adulte. Nous proposons que les phosphatases EDTP et MTMR14 agissent comme des facteurs pro-vieillissement endogènes fixant la vitesse à laquelle les neurones vieillissent en grande partie indépendamment des facteurs environnementaux, et que l'autophagie est influencée par les niveaux d'ADN N6-méthyladénine chez les insectes.

L'accumulation de dommages cellulaires est une caractéristique caractéristique de pratiquement toutes les cellules vieillissantes1,2,3,4,5,6,7. Ces dommages comprennent principalement des protéines oxydées, agrégées et mal repliées (c'est-à-dire non fonctionnelles), qui interfèrent avec les processus cellulaires et l'homéostasie, entraînant ainsi la sénescence et la perte subséquente des cellules affectées. Des niveaux massifs de mort cellulaire peuvent alors conduire au développement de diverses pathologies dégénératives liées à l'âge, notamment des maladies neurodégénératives. Ainsi, l'élimination efficace des matériaux cytosoliques endommagés est cruciale pour le fonctionnement à long terme et la survie des cellules, principalement pour celles qui sont différenciées en phase terminale et ont perdu leur capacité à proliférer, comme les neurones.

L'autophagie agit comme un processus catabolique majeur des cellules eucaryotes par lequel les dommages cellulaires peuvent être efficacement éliminés8,9,10,11,12. Au cours de l'autophagie, des parties du cytoplasme sont délivrées dans les lysosomes pour être dégradées par des hydrolases acides. Selon le mécanisme par lequel la cargaison autophagique est délivrée dans le compartiment lysosomal, trois grands types d'autophagie peuvent être distingués : la microautophagie, l'autophagie médiée par le chaperon et la macroautophagie. La macroautophagie (ci-après dénommée autophagie) implique la formation d'une vésicule à double membrane appelée autophagosome pour séquestrer les matériaux cytoplasmiques destinés à la dégradation. L'autophagosome fusionne ensuite avec un lysosome pour former un autolysosome, dans lequel la dégradation enzymatique a finalement lieu (Fig. 1, A). Des défauts du processus autophagique sont impliqués dans le développement de diverses pathologies neurodégénératives9,13,14. Cela soulève la possibilité que l'autophagie fonctionne moins efficacement dans les neurones à un âge avancé par rapport aux premiers stades adultes. Chez le nématode Caenorhabditis elegans et la mouche des fruits Drosophila melanogaster, l'autophagie s'est en effet révélée opérer à des niveaux significativement plus faibles chez les animaux âgés que chez les jeunes adultes15,16,17. Ce déclin lié à l'âge de la capacité autophagique s'accompagne d'une diminution de l'expression d'un gène clé lié à l'autophagie (Atg), Atg8/LC3B (protéines associées aux microtubules 1A/1B chaîne légère 3B), qui code pour une protéine de type ubiquitine nécessaire à la la formation de structures membranaires autophagiques18. Malgré son importance physiologique et médicale, on ignore encore en grande partie pourquoi la capacité d'autophagie diminue avec l'âge dans les neurones. Les processus stochastiques, y compris les mutations inactivatrices aléatoires des gènes Atg dans le génome des neurones individuels, devraient certainement contribuer à la désintégration6,7. Des facteurs réglementaires encore largement inexplorés peuvent également intervenir. Selon une étude récente, Rubicon (domaine RUN et domaine riche en cystéine contenant, protéine interagissant avec Beclin 1), qui inhibe l'autophagie en interagissant avec un complexe protéique contenant Beclin 1 (coiled-coil, myosin-like BCL2-interacting protein), Vps15/p150 (Vacuolar protein sorting 15), PI3K (la phosphatidylinositol-3 kinase de classe III) et UVRAG (gène associé à la résistance aux rayonnements ultraviolets) régule de plus en plus négativement le processus au cours du vieillissement chez les vers, les mouches et les souris19. Cependant, la raison pour laquelle Rubicon s'accumule progressivement avec l'âge dans divers types de cellules reste non résolue.

La capacité d'autophagie diminue progressivement avec l'âge dans le cerveau de la drosophile. (A) Le processus macroautophagique des mammifères. Au cours de l'autophagie, les constituants cytoplasmiques indésirables (les protéines et les mitochondries sont indiquées) sont séquestrés dans une vésicule à double membrane appelée autophagosome. L'autophagosome est formé par l'allongement et la fusion d'une membrane phagophore. Le schéma indique où les marqueurs autophagiques Atg5, classe III PI3K, Atg8/LC3B-II et SQSTM1/p62 exercent leurs effets au cours du processus. Atg5 et PI3K (ce dernier est indiqué par 2xFYVE-GFP) marquent les premiers stades du processus (formation de phagophores), Atg8/LC3B-II désigne à la fois les phagophores et les autophagosomes, tandis que p62 est une protéine adaptatrice servant de substrat pour la dégradation autophagique. Atg8-I : forme soluble ; Atg8-II : forme conjuguée à la membrane. La cystéine protéase Atg4 déconjugue Atg8-II de la membrane autophagosomale (c'est-à-dire qu'elle assure la conversion de Atg8-II en Atg8-I) lorsque l'autophagosome est formé. MTMR14 inhibe la formation de membranes autophagiques en antagonisant le complexe PI3K de classe III. Les barres indiquent les interactions réglementaires négatives, les flèches indiquent les activations. (B) Niveaux de Atg5- (première rangée), 2xFYVE-GFP- (deuxième rangée), eGFP-Atg8a (troisième rangée) et Ref(2)P/p62-positives (quatrième rangée) dans le cerveau des adultes de drosophile à âges différents. Atg5 et 2xFYVE-GFP marquent les structures autophagiques précoces, les phagophores et les autophagosomes naissants. Dans chaque rangée, des images microscopiques à fluorescence ont été capturées avec le même temps d'exposition. Pour 2xFYVE-GFP, un transgène marqué GFP a été utilisé, sinon des anticorps spécifiques ont été utilisés. Les barres d'échelle correspondent à 25 µm. La coloration Hoechst (bleu) indique les noyaux. (B′–B″″) Quantification des structures Atg5-, 2xFYVE-GFP-, eGFP-Atg8a- et Ref(2)P-positives. (C) Analyse Western blot montrant les niveaux relatifs de Ref(2)P et Atg8a-I/II dans des extraits de tête entière disséqués à différents stades adultes. Atg8a-II marque les phagophores et les autophagosomes. α-Tub84B a été utilisé comme contrôle interne. (C, C″) Quantification des densités relatives de Ref(2)P, ainsi que des niveaux relatifs d'Atg8-I et d'Atg8-II déterminés par l'analyse Western blot (C). Dans les panneaux (B′–B″″), (C′) et (C″), sur le graphique, les cases représentent les 50% les plus typiques des échantillons, la ligne indique la médiane, les moustaches supérieures et inférieures montrent les 25– 25% des échantillons. Les cercles marquent les valeurs aberrantes. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 à chaque comparaison avec le jour 1. Pour les statistiques, voir les "Matériels et méthodes".

La formation de structures membranaires autophagiques précoces nécessite certains dérivés de phosphoinositides (PI) tels que le phosphatidylinositol 3-phosphate (PI3P), qui est converti à partir de PI par l'enzyme de classe III PI3K (Fig. 1A)20. PI3K, également appelé Vps34 (tri des protéines vacuoles), fait partie du complexe de nucléation des vésicules autophagiques. Dans des conditions normales, la phosphatase lipidique liée à la myotubularine de mammifère MTMR14 et son orthologue de drosophile EDTP (tyrosine phosphatase dérivée de l'œuf) antagonisent PI3K/Vps34 pour empêcher l'hyperactivation nocive de l'autophagie21,22,23. MTMR14 inhibe l'autophagie basale en convertissant PI3P en PI24. Dans les fonds génétiques défectueux pour MTMR14 ou EDTP, la quantité de structures enrichies en PI3P devient élevée par rapport au contrôle22,25. Outre cette étape initiale de l'autophagie, MTMR14 régule également une étape ultérieure du processus, lors de la fusion de l'autophagosome avec un lysosome (Fig. 1A)22. Dans cette étude, nous montrons que l'EDTP et le MTMR14 s'accumulent de plus en plus avec l'âge dans les neurones du cerveau. Ces phosphatases lipidiques MTMR conservées contribuent au déclin dépendant de l'âge de l'autophagie dans les neurones, favorisant ainsi le vieillissement cérébral.

Pour mieux comprendre comment l'autophagie décline avec l'âge, nous avons d'abord déterminé les niveaux relatifs de l'activité autophagique au cours de la durée de vie adulte chez la drosophile. Deux marqueurs largement utilisés pour surveiller les premiers stades de l'autophagie, Atg5 et le domaine 2xFYVE (Fig. 1A) 26, 27, ont affiché des niveaux d'accumulation progressivement décroissants dans les cerveaux isolés de mouches adultes à différents stades de la vie (Fig. 1B – B″). Parce que Atg5 joue un rôle dans l'extension de la membrane d'isolement en croissance appelée phagophore, son niveau est corrélé à la quantité de la structure28. Le domaine FYVE lie PI3P, sa quantité est donc proportionnelle à l'activité PI3K/Vps3429. L'application de ces marqueurs a clairement démontré que la formation de phagophores diminue progressivement dans les neurones cérébraux à mesure que l'organisme vieillit. Nous avons également évalué la quantité de la forme conjuguée à la membrane autophagique d'Atg8a, Atg8a-II30. La quantité de structures autophagiques positives pour Atg8a marquées par un rapporteur eGFP-Atg8a exprimé de manière endogène est devenue progressivement élevée dans le cerveau au cours de la vie adulte (Fig. 1B – B ‴). Parce que l'eGFP est sensible à un pH bas, il est inactif dans les compartiments acides, marquant ainsi les phagophores et les autophagosomes, mais pas les autolysosomes. Des résultats similaires ont été obtenus lors du test des niveaux d'Atg8a-II dans des extraits de cerveau provenant d'animaux adultes à différents stades, à l'aide d'une analyse Western blot (Fig. 1C, C″). Contrairement à Atg8a-II, le niveau de la forme soluble non conjuguée d'Atg8a (Atg8a-I) est resté presque constant tout au long de l'âge adulte. Ces données indiquent que, malgré la formation réduite de phagophores, les autophagosomes ont été générés à un rythme progressivement croissant au cours de la durée de vie adulte. Alternativement, une étape ultérieure du processus de dégradation a également été affectée, conduisant à une accumulation nette d'autophagosomes ou d'autolysosomes non digestifs. Peut-être la fusion autophagosome-lysosome, l'acidification lysosomale ou la dégradation du contenu autolysosomal est l'étape impactée.

Pour faire la distinction entre les deux alternatives ci-dessus, nous avons évalué la quantité de Ref(2)P, la contrepartie de la mouche humaine p62/SQSTM1 (Sequestosome 1) pendant la durée de vie adulte15. Parce que p62/SQSTM1 sert de substrat pour la dégradation autophagique (la protéine relie la cargaison à Atg8/LC3B lié à la membrane), son niveau est inversement proportionnel à l'activité autophagique32,33. À l'aide d'un anticorps spécifique de Ref(2)P, nous avons effectué une analyse immunohistochimique sur des échantillons de cerveau disséqués à différents stades adultes et avons constaté que plus l'animal est âgé, plus la quantité d'agrégats de protéines insolubles marquées par l'anticorps est élevée (Fig. 1B, B″″). Pour renforcer ces résultats, une analyse Western blot ultérieure a été appliquée à des échantillons de tête entière, en utilisant le même anticorps spécifique de Ref(2)P. Conformément aux données obtenues par microscopie à fluorescence, la quantité de protéine Ref (2) P soluble est devenue progressivement élevée avec l'âge dans les extraits de tête (Fig. 1C, C '). Ensemble, ces résultats impliquent qu'au cours du vieillissement, la dégradation autophagique est altérée à deux étapes du processus. Tout d'abord, comme le révèlent les niveaux réduits d'Atg5 et de PI3P, lors de la nucléation des vésicules lorsque le phagophore se forme et se développe. Deuxièmement, comme indiqué par l'augmentation de l'accumulation d'Atg8a-II, après la formation de l'autophagosome lorsque la structure fusionne avec un lysosome ou que le contenu autolysosomal est digéré par voie enzymatique. Nous concluons que l'autophagie diminue progressivement avec l'âge dans les neurones du cerveau en raison de l'effet cumulatif de la suppression de la formation d'autophagosomes et de la fonction autolysosomale compromise.

Il a été démontré que MTMR14 influence l'autophagie aux stades précoces (formation de phagophores) et tardifs (formation d'autolysosomes) du processus (Figs. 1A, 2A)22. De plus, nous avons démontré précédemment que l'EDTP inhibe efficacement l'autophagie basale dans le corps gras de la drosophile23,25,34 et que le MTMR14 s'accumule abondamment dans le cortex cérébral humain35. Ici, nous avons révélé que les niveaux d'Atg8a-II et de Ref (2) P augmentent dans un fond génétique surexprimant l'EDTP (Fig. 2B – B ‴), mais plus bas dans un fond mutant hypomorphe EDTP (Fig. 2C – C ‴). De plus, la surexpression de l'EDTP a augmenté de manière significative la quantité de structures ubiquitinées (Fig. S1A-A '). Cela suggère que dans des conditions normales, l'EDTP inhibe également l'autophagie, en plus de la formation d'autophagosomes, après la lipidation d'Atg8a.

L'hyperactivité EDTP inhibe, tandis que la déficience en EDTP améliore, l'activité autophagique dans le cerveau de la drosophile. (A) Fonction enzymatique de l'EDTP de drosophile et des phosphatases lipidiques MTMR14 de mammifères. Les deux protéines convertissent PI3P en PI, s'opposant ainsi à la formation de membranes autophagiques. (B) L'analyse Western blot démontre des niveaux élevés d'EDTP et de Ref(2)P dans un contexte génétique surexprimant l'EDTP par rapport au contrôle. La forme conjuguée à la membrane autophagique d'Atg8a (Atg8a-II) augmente également par rapport à Atg8a-I, qui représente la forme soluble (non conjuguée) d'Atg8a. (B′–B‴) Quantification des niveaux relatifs d'EDTP, de Ref(2)P, d'Atg8a-I et d'Atg8a-II, déterminés par l'analyse Western blot (B). (C) L'analyse Western blot révèle que les niveaux relatifs d'EDTP, Ref(2)P et le rapport Atg8a-II/Atg8a-I diminuent chacun dans un fond génétique défectueux EDTP (mutant hypomorphe) par rapport au contrôle. (C′ – C‴) Quantification des densités relatives EDTP, Ref(2)P, Atg8a-I et Atg8a-II identifiées par l'analyse Western blot (C). Dans les panneaux B et C, les protéines ont été extraites de la tête des mouches des fruits femelles, αTub84B a été utilisé comme contrôle interne et les animaux ont été maintenus à 29 ° C. Sur le graphique, les cases représentent les 50 % les plus typiques des échantillons, la ligne indique la médiane, les moustaches supérieures et inférieures montrent les 25 à 25 % restants des échantillons. Les cercles marquent les valeurs aberrantes. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001. Pour les statistiques, voir les "Matériels et méthodes".

Pour mieux comprendre les rôles neuronaux de l'EDTP dans le contrôle de l'autophagie, nous avons surveillé la co-localisation des rapporteurs mCherry-Atg8a et GFP-Lamp1 (spécifiques de la structure lysosomale) chez des adultes de 7 et 21 jours maintenus à 29 ° C (Fig. 3A, A′ et Fig. S1B–B‴). Le silençage de l'EDTP (EDTP-RNAiV22) et la surexpression (EDTPGSV6) ont chacun augmenté la co-localisation de ces marqueurs chez les animaux âgés par rapport au contrôle au même âge. Dans les génotypes témoins, la quantité de structures marquées par les deux marqueurs était significativement plus élevée chez les adultes âgés que chez les jeunes (Fig. 3A″ – A‴ et Fig. S1B′). La régulation à la baisse de l'EDTP a augmenté, tandis que l'hyperactivité de l'EDTP a diminué, le nombre de structures spécifiques à mCherry-Atg8a et GFP-Lamp1 (Fig. 3A ", A" et Fig. S1B '). La forme lipidée d'Atg8a (Atg8a-II) est un substrat de dégradation autophagique, et le journaliste mCherry tolère le milieu acide des autolysosomes36,37. Cela peut expliquer pourquoi le déficit en EDTP augmente la quantité d'autolysosomes (structures mCherry-Atg8a-positives) dans un test microscopique fluorescent mais diminue les niveaux d'Atg8a-II dans une analyse Western blot (Fig. 3A, A″ et Fig. 2C, C‴) . Ainsi, la surexpression de l'EDTP pourrait inhiber l'autophagie en générant moins de structures autophagiques. Bien que ces structures soient capables de fusionner avec les lysosomes, le processus de dégradation semble être compromis (comme indiqué par l'accumulation des niveaux d'Atg8a-II et l'augmentation de la co-localisation de mCherry-Atg8a—GFP-Lamp1) (Figs. 2, 3). Les protéines MTMR sont connues pour déphosphoryler les lipides impliqués dans l'autophagie, tels que le PI(3,5)P238, qui est nécessaire pour les étapes en aval du processus autophagique, y compris l'acidification des lysosomes39 et la biogenèse lysosomale40. Selon nos résultats, l'EDTP peut simultanément bloquer la nucléation des vésicules (via le complexe Vsp34 antagoniste) et la dégradation lysosomale dans les neurones.

L'EDTP inhibe à la fois la nucléation des vésicules autophagiques et la dégradation acide dans le cerveau de la drosophile. (A) Images fluorescentes montrant la co-localisation des reporters GFP-Lamp1 (vert) et 3xmCherry-Atg8a (rouge) dans les neurones du cerveau de la drosophile adulte. Les flèches jaunes indiquent les structures étiquetées par les deux marqueurs. Les carrés blancs indiquent les zones agrandies. Sur les diagrammes, les données statistiques d'échantillons issus d'animaux aux stades adultes de 7 et 21 jours sont présentées (A′–A‴). Les animaux ont été maintenus à 29 °C. Sur le graphique, les cases représentent les 50 % les plus typiques des échantillons, la ligne indique la médiane, les moustaches supérieures et inférieures montrent les 25 à 25 % restants des échantillons. Les cercles marquent les valeurs aberrantes. P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001. Pour les statistiques, voir les "Matériels et méthodes".

Les données et résultats pertinents de la littérature ci-dessus nous ont incités à examiner les niveaux relatifs associés au stade adulte (c'est-à-dire la dynamique d'accumulation) de ces phosphatases lipidiques MTMR conservées dans les neurones cérébraux tout au long de la vie adulte. À cette fin, nous avons dosé l'accumulation d'EDTP dans le cerveau tout au long de la vie adulte. L'expression de l'EDTP a d'abord été surveillée par un système de piège à gène fluorescent, dans lequel un pilote de Troie EDTP-Gal4 est inséré dans la première séquence intronique du gène EDTP, contrôlant l'activité du rapporteur UAS-myr-GFP (Fig. S2A). L'activité EDTP a montré une augmentation progressive, associée à l'âge, de l'organe (Fig. 4A, A '). Une différence presque triple a été détectée entre les adultes jeunes (jour 10) et âgés (jour 60). Ce changement lié à l'âge dans la transcription de l'EDTP était particulièrement évident dans les structures cérébrales appelées corps de champignon, ganglions sous-œsophagiens et lobes antennaires (Fig. 3A et Fig. S1B), et ne s'accompagnait pas d'une augmentation du nombre de neurones accumulant l'EDTP (Fig. S2C,C′). Au cours du vieillissement, les niveaux de marqueurs autophagiques ont changé de manière significative dans la zone du corps du champignon ; la quantité de structures marquées par 2xFYVE-GFP a diminué tandis que les niveaux de Ref (2) P ont augmenté (Fig. S2D – E '). Une analyse PCR quantitative sur des échantillons de tête a également montré des quantités plus élevées de transcrits EDTP chez les animaux âgés par rapport aux jeunes (Fig. 4B). Ces résultats révèlent que les niveaux de transcription EDTP augmentent progressivement dans les neurones du cerveau à mesure que l'animal vieillit, ce qui est conforme à une précédente analyse de l'expression génique à l'échelle du génome identifiant les facteurs génétiques qui sont régulés à la hausse ou à la baisse au cours du vieillissement de la drosophile41.

L'EDTP est de plus en plus exprimé dans les structures cérébrales au cours de la vie adulte de la drosophile. (A) Images microscopiques à fluorescence montrant l'expression d'un système de piège à gène EDTP-troyen (activité transcriptionnelle de l'EDTP) dans le cerveau disséqué à différents stades de l'âge adulte (les jours sont indiqués). Les images ont été capturées avec le même temps d'exposition. La coloration Hoechst (bleu) indique les noyaux. Les astérisques rouges indiquent les médulles (luminosité intense) qui ont été exclues de l'analyse. La barre d'échelle correspond à 100 µm. Une ligne pointillée blanche décrit la section du cerveau où l'analyse a été effectuée. (A ') Quantification des niveaux d'expression relatifs d'EDTP dans le cerveau de mouches adultes à différents âges. (B) L'analyse qPCR sur des extraits de cerveau montre que les niveaux de transcription EDTP sont plus élevés chez les adultes âgés (jour 50 et jour 60) que chez les jeunes adultes (jour 10). (C) L'analyse Western blot révèle que l'EDTP a tendance à s'accumuler avec l'âge dans les extraits de tête de drosophile. αTub84B a été utilisé comme contrôle interne. (C ') Quantification des niveaux relatifs d'EDTP dans les extraits de tête à différents stades adultes, déterminés par l'analyse Western blot (C). Les animaux ont été maintenus à 25°C. Dans les panneaux (A′)), (B) et (C′)), les cases représentent les 50 % les plus typiques des échantillons, la ligne indique la médiane, les moustaches supérieures et inférieures montrent les 25 % à 25 % restants des échantillons . Les cercles marquent les valeurs aberrantes. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 à chaque comparaison avec le jour 1. Pour les statistiques, voir les "Matériels et méthodes" et le tableau S1. (D) La méthylation de la N6-adénine au locus EDTP augmente progressivement avec l'âge chez la drosophile. Niveaux relatifs de N6-méthyladénine (6 mA) au locus EDTP à différents stades adultes. (D ') Quantification des niveaux relatifs de 6 mA sur le site EDTP. Les animaux ont été maintenus à 29 °C. Dans les panels (D′), *P < 0,05, **P < 0,01 à chaque comparaison avec le jour 7.

En utilisant un anticorps spécifique à l'EDTP, nous avons ensuite testé la quantité de protéine dans des extraits de tête entière. L'anticorps était capable de marquer l'EDTP dans le type sauvage, mais n'a en grande partie pas réussi à marquer une bande EDTP-positive dans le fond mutant EDTPMI08496 (Fig. 2C – C ‴). Une analyse Western blot menée a révélé que l'EDTP a tendance à s'accumuler de plus en plus dans la tête au cours de la vie adulte (Fig. 4C – C '). Ainsi, l'activité de l'EDTP augmente progressivement avec l'âge dans le cerveau de la drosophile.

Pour comprendre pourquoi l'expression de l'EDTP augmente avec l'âge dans les neurones cérébraux, nous avons examiné les modifications de la modification de l'ADN de la N6-méthyladénine (6 mA) au locus EDTP tout au long de l'âge adulte (en général, la méthylation de l'adénine sur la position N6 favorise la transcription au locus affecté). Les niveaux relatifs de 6 mA sur tout site génomique contenant une séquence GATC peuvent être évalués par une méthode basée sur la PCR, qui implique une digestion enzymatique DpnI sensible à la méthylation de l'ADN génomique et une amplification par PCR du site cible (Fig. 4D)42. Nous avons constaté que les niveaux relatifs de 6 mA au site cible ont tendance à augmenter au cours de la durée de vie de l'adulte, une baisse des niveaux de 6 mA ne pouvant être observée qu'aux derniers stades adultes (Fig. 4D – D '). Ainsi, les changements liés à l'âge dans l'expression de l'EDTP et, par conséquent, les changements dans l'activité autophagique, peuvent être épigénétiquement déterminés dans cet organisme. Fait intéressant, un changement similaire n'était pas détectable dans le cas du gène MTMR14 humain (données non présentées).

Le mouvement défectueux est une caractéristique des mouches âgées2,3,30,39,41. Étant donné que la locomotion est coordonnée par les neurones, nous avons examiné la capacité d'escalade chez des animaux témoins par rapport à des animaux déficients en EDTP (c'est-à-dire hyperactifs en autophagie) à différents stades adultes. La régulation à la baisse de l'EDTP a été spécifiquement obtenue dans les neurones dopaminergiques en utilisant un pilote ple-Gal4 et deux constructions d'ARNi indépendantes et efficaces, EDTP-ARNi (V22) et EDTP-ARNi (ARNdb) (voir le "Matériel et méthodes" et Figs. S3A –D′, S4A–A′). Les deux traitements ont considérablement augmenté la capacité des animaux à grimper sur la paroi d'un flacon en verre dans un certain délai (Fig. 5A, A 'et Fig. S3A'). Dans le cas de la construction EDTP-ARNi (ARNdb), l'amélioration du mouvement était évidente même aux stades adultes ultérieurs (jours 21 et 28, Fig. 5A, A '). À partir de ces résultats, nous concluons qu'une diminution de l'activité autophagique associée à l'âge dans des neurones spécifiques contribue à une altération de la locomotion des personnes âgées, et cet effet peut être significativement retardé ou atténué par une déficience en EDTP dans les neurones affectés. Il convient de noter que dans une expérience de contrôle, la régulation à la baisse de l'EDTP a nettement augmenté, tandis que l'hyperactivité de l'EDTP a diminué, le nombre de structures autophagiques précoces positives pour 2xFYVE-GFP dans les cellules affectées aux stades adultes jeunes et âgés (Fig. S5).

La régulation à la baisse de l'EDTP dans les neurones peut améliorer la capacité d'escalade, réduire l'ubiquitination des protéines dans le cerveau et prolonger la durée de vie. (A – A ') En utilisant deux constructions ARNi différentes (voir également Fig. S2B, B '), l'EDTP était une régulation négative dans les neurones dopaminergiques. Les mouches ont été maintenues à 29 ° C, l'eGFP-ARNi (indique le contrôle du transgène UAS sans cible ON) et l'EDTP-ARNi ont été pilotés par un pilote ple-Gal4 exprimé uniquement dans les neurones dopaminergiques. (B) Images fluorescentes montrant l'accumulation de protéines ubiquitinées (agrégats verts) dans le cerveau de mouches adultes à différents stades (7 et 21 jours). eGFP-ARNi a été utilisé comme contrôle. La coloration Hoechst (bleu) indique les noyaux. Les animaux ont été maintenus à 29 °C. La barre d'échelle représente 40 µm. Les constructions d'ARNi ont été pilotées par Appl-Gal4. (B′) Quantification des protéines ubiquitinées à deux stades adultes différents. (C) Courbes de durée de vie de Kaplan-Meyer de l'eGFP-ARNi (contrôle de l'ARNi libre sur cible) par rapport à l'EDTP-ARNi (ARNdb) (l'EDTP a été régulé à la baisse dans les neurones dopaminergiques spécifiquement). Les animaux ont été maintenus à 25°C. (C′) Données sur la durée de vie moyenne des animaux figurant sur le panneau (C). ( D ) Courbes de durée de vie de Kaplan – Meyer de l'eGFP-ARNi (contrôle de l'ARNi sans cible ON), par rapport aux animaux EDTP-ARNi (V22) et EDTP-ARNi (ARNdb) (l'EDTP était régulé à la baisse uniquement dans les neurones dopaminergiques). Les mouches ont été maintenues à 29 °C. (D′) Données sur la durée de vie moyenne des animaux figurant sur le panneau (D). Dans les panneaux (A), (A′), (B′), (C′) et (D′), les cases représentent les 50 % les plus typiques des échantillons, la ligne indique la médiane, les moustaches supérieures et inférieures montrent les autres 25 % à 25 % des échantillons. Les cercles marquent les valeurs aberrantes. * P < 0, 05, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001, l'analyse statistique a été effectuée comme décrit dans les matériaux et méthodes, pour les statistiques, voir le tableau S1.

Chez les personnes âgées, les protéines cytoplasmiques deviennent souvent ubiquitinées, et cette marque moléculaire aide les facteurs marqués à subir une dégradation protéasomique ou autophagique. Nous avons testé l'accumulation liée à l'âge de protéines ubiquitinées dans des échantillons de cerveau normaux versus défectueux EDTP, en utilisant un pilote pan-neuronal Appl-Gal4 qui est actif dans pratiquement tous les neurones. Dans les échantillons témoins, les niveaux de structures marquées à l'ubiquitine ont augmenté de manière significative avec l'âge, et ce changement a été efficacement supprimé par la régulation négative de l'EDTP (Fig. 5B, B '). La régulation à la baisse de l'EDTP a augmenté la quantité de structures positives pour mCherry-Atg8a et GFP-Lamp1 (Fig. S3C – D ') et a considérablement diminué les niveaux de Ref (2) P chez les animaux de 21 jours maintenus à 29 ° C, par rapport à avec contrôle (Fig. S4C–D′). Ainsi, l'amélioration de l'activité autophagique en inhibant la fonction EDTP protège les neurones contre l'accumulation de protéines endommagées, ce qui est une caractéristique générale dans diverses pathologies neurodégénératives.

Parce que l'autophagie joue un rôle central dans la régulation du processus de vieillissement2,3,4,43 et que le vieillissement est contrôlé par des systèmes de signalisation qui agissent dans des neurones spécifiques16, nous avons également testé l'effet de la régulation négative de l'EDTP spécifique aux neurones dopaminergiques sur la durée de vie. L'EDTP a été spécifiquement régulé négativement à l'âge adulte en utilisant le pilote ple-Gal4 et deux constructions ARNi indépendantes (Fig. S3A – B '; les animaux ont été maintenus en continu à 25 ou 29 ° C). Nous avons observé que les animaux régulés à la baisse pour l'EDTP vivent plus longtemps que le témoin aux deux températures testées (Fig. 5C – D 'et Tableau S1). Ces résultats impliquent que l'amélioration de l'activité autophagique dans les neurones dopaminergiques par un déficit en EDTP peut entraîner un effet de longévité. En revanche, la surexpression de l'EDTP limite la durée de vie et interfère avec la capacité d'escalade (Fig. S6A, A ').

Pour répondre à la question de savoir si le rôle régulateur de cette famille de phosphatases lipidiques MTMR dans le vieillissement cérébral est conservé au cours de l'évolution, nous avons ensuite surveillé les changements liés à l'âge de l'activité autophagique et l'accumulation de MTMR14 dans les neurones du cerveau humain. Les niveaux de p62/SQSTM1 ont d'abord été déterminés dans des échantillons de cerveau humain post-mortem isolés à différents âges adultes (moyens et âgés). Nous avons constaté que la protéine s'accumule plus abondamment dans les neurones cérébraux chez les personnes âgées (70 à 80 ans) que chez les plus jeunes (40 à 55 ans) (Fig. 6A, A 'et Tableau S2). Ainsi, une diminution progressive de la capacité d'autophagie peut également se produire au cours du vieillissement cérébral chez l'homme. À la lumière de ce changement négatif de l'activité autophagique, on peut expliquer pourquoi les neurones non proliférants ont tendance à accumuler progressivement des dommages cellulaires et à devenir de plus en plus sensibles à la mort au fil du temps, conduisant au développement de diverses affections neurodégénératives à des âges avancés.

Le SQSTM1/p62 et le MTMR14 humains s'accumulent avec l'âge dans les neurones du cerveau. (A) Images fluorescentes montrant l'accumulation de SQSTM1 (vert) dans des échantillons de cerveau humain post-mortem à l'âge de 42 ans (à gauche) et 71 ans (à droite). Les cases blanches indiquent la zone agrandie (à droite). Les images ont été capturées avec le même temps d'exposition. La coloration DAPI (bleu) indique les noyaux. Un anticorps humain spécifique de SQSTM1 a été utilisé pour l'immunohistochimie. (A ') Quantification des niveaux de SQSTM1 dans des échantillons de cerveau humain à différents stades adultes. SQSTM1 s'accumule plus abondamment dans les échantillons âgés par rapport aux jeunes. (B) NeuN (vert)-MTMR14 (rouge) neurones à double immunocoloration avec DAPI (bleu) dans la couche 3 du cortex temporal (BA 38) d'un "jeune" (up, SKO20, 27 ans) et chez un sujet "vieux" (en bas, SKO18, 85 ans), photographié par un microscope confocal à fluorescence. Les cellules immunopositives NeuN sont vertes, les points immunopositifs MTMR14 (petites flèches blanches) sont rouges, les noyaux sont bleus. Les cases en pointillés blancs indiquent la zone agrandie (à droite), les images du panneau de droite affichent le canal rouge (immunomarquage MTMR14). Les pointes de flèches jaunes montrent la lipofuscine autofluorescente (gouttes violettes). La lipofuscine est présente dans les deux échantillons, mais elle est plus abondante chez le sujet « âgé ». Des points marqués MTMR14 (pointes de flèches rouges) sont visibles dans les corps cellulaires et les dendrites. Les barres d'échelles correspondent à 10 µm. (B′) Boîte à moustaches de la zone couverte par l'immunpositivité MTMR14 en pourcentage de la surface cellulaire par cas. La positivité de MTMR14 a été mesurée dans les cellules de la couche 3d de sections corticales temporales immunocolorées par MTMR14. Le graphique montre que la zone d'immunopositivité MTMR14 est plus élevée chez les sujets âgés que chez les plus jeunes. Notez la forte variance individuelle entre les cellules dans la plupart des cas. Les six sujets ont été divisés en deux groupes comme "jeunes d'âge moyen" contenant des sujets de 27, 55 et 61 ans contre "vieux" contenant des sujets de 72, 77 et 85 ans. Les deux groupes sont significativement différents selon le test t. (C) Analyse Western blot montrant que MTMR14 a tendance à s'accumuler avec l'âge dans les échantillons de cortex humain. GAPDH a été utilisé comme contrôle interne. (C ') Quantification des niveaux de protéines EDTP dans les groupes d'âge moyen et âgés, déterminés par l'analyse Western blot (C). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Pour les statistiques, voir le tableau S1. (D) L'analyse RT-qPCR démontre que les niveaux d'ARNm de MTMR14 augmentent avec l'âge dans le cortex humain. GAPDH a été utilisé comme contrôle interne. Trois individus d'âge moyen (47 à 58 ans) et trois individus âgés (85 à 94 ans) ont été comparés. Les groupes sont significativement différents selon le test U de Mann-Whitney, pour plus d'informations sur les échantillons, voir le tableau S5, *** P < 0,001. (E) RT-qPCR a été réalisée pour évaluer les niveaux d'ARNm de MTMR14 dans des échantillons de cortex préfrontal. 9 individus jeunes (1 à 3 ans) et 6 individus âgés (13 à 17 ans) de différentes races ont été comparés (pour les données d'échantillon, voir le tableau S6). Des tests TaqMan commerciaux ont été utilisés pour cibler l'orthologue canin MTMR14 (ThermoFisher, Cf02682018_g1). GAPDH (glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase) a été utilisé comme gène de référence (Cf04419463_gH). Sur le graphique, les cases représentent les 50 % les plus typiques des échantillons, les lignes indiquent la médiane, les moustaches supérieures et inférieures montrent les 25 à 25 % restants des échantillons. Les cercles marquent les valeurs aberrantes. **P < 0,01, test t indépendant à deux échantillons. (F) Modèle montrant comment les phosphatases lipidiques EDTP/MTMR14 influencent le vieillissement cérébral. L'activité EDTP/MTMR14 (courbe rouge) augmente progressivement dans les neurones tout au long de la vie adulte, régulant ainsi progressivement l'autophagie à mesure que l'organisme vieillit (courbe verte). En conséquence, les dommages cellulaires s'accumulent de plus en plus avec l'âge dans les neurones (courbe grise). Les lignes pointillées vertes et grises indiquent les niveaux physiologiques relatifs (basaux) d'autophagie et d'activité MTMR14/EDTP, respectivement. La ligne jaune indique les niveaux relatifs de 6 mA au locus EDTP. Aux stades adultes plus avancés, les deux phosphatases lipidiques agissent comme des facteurs endogènes de pro-vieillissement.

Dans les cellules HeLa et C2C12 (myoblastes de souris), il a été démontré que MTMR14 se localise dans les structures autophagiques22. Ici, nous avons testé la quantité de particules positives pour MTMR14 dans le cortex cérébral de patients humains d'âges différents. À l'aide d'un anticorps humain spécifique de MTMR14, une analyse immunohistochimique a été réalisée et les résultats ont démontré que, comme ce que nous avons trouvé chez la drosophile, les quantités de structures marquées par MTMR14 augmentent également avec l'âge dans les neurones cérébraux (Fig. 6B, B 'et Tableau S3). Ces résultats ont été confirmés par une analyse parallèle appliquant un autre anticorps spécifique de MTMR14 sur un ensemble indépendant d'échantillons de cerveau provenant de patients non déments (Fig. S7A, A 'et Tableau S4). Une analyse Western blot ultérieure a ensuite été menée pour quantifier les niveaux de MMR14 soluble dans des échantillons de cortex cérébral humain, et nous avons observé des intensités beaucoup plus élevées dans les échantillons âgés (85 à 94 ans) par rapport à ceux d'âge moyen (47 à 58 ans) (Fig. 6C, C′, Fig. S7B et Tableau S5). Les niveaux de transcription MTMR14 ont également été déterminés dans ces échantillons à l'aide d'une analyse qPCR et, selon les résultats, le gène était exprimé à des niveaux plus élevés dans les anciens échantillons que dans les jeunes (Fig. 6D, Fig. S7C et Tableau S5). Ainsi, la régulation transcriptionnelle de MTMR14 peut contribuer à l'amélioration des niveaux (activité) du produit génique à des âges avancés. Ces derniers résultats sont en corrélation avec les données d'expression spécifiques au cortex cérébral humain disponibles gratuitement sur GTExPORTAL (https://gtexportal.org), selon lesquelles MTMR14 est de plus en plus exprimé avec l'âge chez les deux sexes (Fig. S7D).

Pour révéler que l'expression de MTMR14 affiche une augmentation liée à l'âge dans le cortex cérébral d'une autre espèce de mammifère, nous avons finalement déterminé les niveaux d'ARNm de MTMR14 chez les chiens jeunes par rapport aux chiens âgés (Fig. 6E et Tableau S6). Les résultats ont montré que MTMR14 est plus actif chez les animaux âgés que chez les jeunes. Dans l'ensemble, une activité autophagique réduite dans les neurones à un âge avancé par rapport au jeune âge adulte peut être une conséquence de l'augmentation de l'accumulation de MTMR14 au cours de la vie.

Dans cette étude, nous avons montré que les protéines Drosophila Ref(2)P et p62 humaines servant de substrat à la dégradation autophagique s'accumulent progressivement dans le cerveau au cours du vieillissement (Figs. 1B, B″″, C, C′ et 6A, A′) . Ce changement progressif des niveaux de Ref(2)P/p62 indique un déclin lié à l'âge de la capacité d'autophagie dans cet organe, expliquant pourquoi les neurones accumulent de plus en plus de dommages cellulaires tout au long des derniers stades adultes et deviennent sensibles à la sénescence et, par la suite, à la mort. Nous avons en outre démontré qu'à des âges avancés, l'autophagie est altérée à deux stades distincts. Tout d'abord, à un stade précoce lorsque le phagophore/autophagosome est formé (Fig. 1B – B″). Deuxièmement, à un stade ultérieur, lorsque l'autophagosome fusionne avec un lysosome ou que le contenu autolysosomal est dégradé par des hydrolases acides (Fig. 1B – C″). Ces résultats suggèrent que l'altération de l'autophagie au cours du vieillissement est due, au moins en partie, à un mécanisme de régulation (génétique).

L'autophagie joue un rôle central dans le contrôle du vieillissement2,3,4,44. Il intervient dans l'élimination des constituants cytoplasmiques endommagés et son activité est influencée par diverses voies de longévité, sinon toutes, telles que la signalisation insuline/IGF1 (facteur de croissance analogue à l'insuline) et TOR (kinase cible de la rapamycine), le système respiratoire mitochondrial , et l'appareil moléculaire sous-jacent à la restriction calorique43. Les gènes qui régulent négativement l'autophagie chez les organismes âgés contribuent certainement à la détérioration des organes et des tissus, favorisant ainsi le développement de diverses maladies dégénératives associées à l'âge. Cependant, le fonctionnement de ces systèmes de régulation dépend en grande partie de facteurs environnementaux, tels que la disponibilité de la nourriture, la concentration en oxygène et la température, et influence l'autophagie même dans les cellules non vieillissantes, comme la lignée germinale et les cellules souches cancéreuses, dans lesquelles la dégradation autophagique ne devrait pas tomber. irrévocablement. Nous proposons que dans le vieillissement des cellules somatiques, des facteurs endogènes spécifiques devraient déterminer la vitesse à laquelle la capacité d'autophagie diminue progressivement au cours du vieillissement, en grande partie indépendamment des signaux environnementaux. Un tel facteur d'horloge moléculaire qui détermine la vitesse à laquelle les cellules vieillissent en modulant l'activité autophagique est Rubicon, dont il a récemment été démontré qu'il supprime progressivement le processus au cours de la durée de vie adulte chez des taxons animaux divergents19.

Pourquoi l'autophagie serait-elle altérée dans de nombreux neurones à des stades adultes avancés ? En plus des mutations inactivatrices aléatoires dans les gènes Atg, certains facteurs génétiques peuvent réguler négativement l'autophagie chez les adultes âgés. Nous avons démontré que le gène EDTP, qui code pour une phosphatase lipidique conservée liée à la myotubularine interférant avec l'autophagie en antagoniste de PI3K/Vps34 (Fig. 2A)23,25,34, est également de plus en plus exprimé dans le cerveau au cours de la vie adulte (Fig. 4A, B). La protéine EDTP semble également s'accumuler de plus en plus avec l'âge dans cet organe (Fig. 4C – C '). Sa régulation négative dans les neurones a déclenché de manière significative l'autophagie, amélioré la locomotion et prolongé la durée de vie (Fig. 5, Figure S3C-D 'et Fig. S4A'). Conformément à ces résultats, le MTMR14 humain s'est également avéré s'accumuler à des niveaux plus élevés dans les neurones corticaux humains des patients âgés par rapport aux jeunes (Fig. 6B – C ', Fig. S7A – B '). De plus, l'expression de MTMR14 augmentait avec l'âge (Fig. 6D, Fig. S7C, D). Chez les chiens, MTMR14 était exprimé de manière similaire à des niveaux élevés dans le cortex préfrontal cérébral des adultes âgés par rapport aux jeunes (Fig. 6E). Ensemble, comme Rubicon, l'EDTP et le MTMR14 suppriment progressivement l'autophagie au cours de la vie19. L'EDTP et le MTMR14 remplissent tous deux cette fonction aux stades précoce et tardif du processus autophagique (Fig. 1B – C″)22, tandis que Rubicon le fait exclusivement à ce dernier stade19. Sur la base de ces données, on peut conclure que le complexe PI3K de classe III, qui est régulé par la protéine EDTP/MTMR14, peut avoir évolué en tant qu'horloge moléculaire primaire où l'autophagie peut être supprimée de manière dépendante de l'âge. Ainsi, l'activité du complexe sert de signature du vieillissement.

Le vieillissement, un déclin naturel de la condition physique et de la physiologie générale d'un organisme au fil du temps, est entraîné par l'accumulation progressive de dommages cellulaires non réparés1,2,3,4,44. Le processus contribue à l'élimination des adultes post-reproductifs des populations, diminuant ainsi la compétition intraspécifique dans des conditions de ressources limitées. Ainsi, l'émergence de facteurs génétiques favorisant le vieillissement peut renforcer la subsistance à long terme des espèces au détriment de la vie des individus. Dans le cadre du vieillissement de l'organisme, la désintégration progressive des fonctions neuronales limite progressivement la capacité de survie des individus. Dans cette étude, nous avons découvert un nouveau mécanisme de régulation, par lequel le cerveau se détériore à un rythme de plus en plus croissant au cours de la vie adulte. Nous avons démontré que l'EDTP de Drosophila et le MTMR14 humain, deux régulateurs négatifs conservés du processus autophagique22,23,34, s'accumulent progressivement dans les neurones cérébraux tout au long de l'âge adulte (Figs. 4, 6B – C′). Par conséquent, ces protéines orthologues, après avoir traversé un niveau d'accumulation critique dans les neurones à un certain stade adulte, fonctionnent comme des facteurs endogènes de pro-vieillissement qui favorisent le vieillissement cérébral et limitent la durée de vie en régulant de plus en plus négativement l'autophagie au fil du temps (Fig. 6F). En raison de la capacité autophagique décroissante, les neurones deviennent progressivement sensibles à l'accumulation de dommages cellulaires et, par conséquent, à la mort au cours de la vie adulte.

Les phosphatases lipidiques MTMR conservées EDTP et MTMR14 agissent comme des facteurs endogènes qui réduisent de plus en plus l'activité autophagique au cours de la vie, représentant ainsi une nouvelle classe de facteurs de régulation endogènes pro-vieillissement. La fonction de l'EDTP et du MTMR14 dans le contrôle du vieillissement semble être similaire à celle de Rubicon19. En somme, les données présentées dans cette étude révèlent un nouveau mécanisme à l'origine du vieillissement cérébral. Nous suggérons que la sensibilité progressivement croissante des neurones à la mort au cours du vieillissement est génétiquement déterminée. Le vieillissement cérébral, du moins en partie, est un processus régulé, et acquérir une maladie neurodégénérative n'est qu'une question de temps de vie.

Auparavant, nous avons constaté que l'EDTP et le Mtmr6, les orthologues des mouches des mammifères MTMR14 et MTMR6-8, respectivement, fonctionnaient dans le contrôle de l'autophagie21,45,46. Ces protéines exercent leur rôle régulateur de manière condition-dépendante dans le corps gras larvaire (stade L3F) ; L'EDTP inhibe l'autophagie basale mais n'influence pas l'autophagie induite par le stress, tandis que Mtmr6 favorise l'autophagie basale mais inhibe le processus dans diverses conditions de stress. Chez les mammifères, MTMR14 et MTMR8 convertissent chacun PI3P en PI, tandis que MTMR6 bloque la génération de PI(3,5)P238. Dans des conditions de famine et de richesse en nutriments, MTMR14 inhibe l'autophagie alors que MTMR6 n'influence l'autophagie induite par la famine que 22. Ainsi, MTMR14 et MTMR6 ont des rôles distincts dans différents systèmes modèles. À l'avenir, il convient d'étudier la relation fonctionnelle de ces protéines dans le système nerveux adulte et dans la détermination de la durée de vie.

Les mouches ont été maintenues à 25 °C ou 29 °C avec un nutriment normal de semoule de maïs pour mouches. Les souches ont été commandées auprès du Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) et du Drosophila Genetic Resource Center, Kyoto (DGRC), ou ont été aimablement fournies par un autre chercheur ou générées et décrites par nous plus tôt.

Pour l'immunohistochimie et la microscopie à fluorescence, des animaux w[1118] (BDSC : 5905) et UAS-GFP-2xFYVE (II) (BDSC : 42712) (croisés avec Appl-Gal4) ont été utilisés, respectivement. L'expression endogène de GFP-Atg8a a été décrite dans la Réf.31.

Pour l'analyse Western blot, w[1118] a été utilisé comme contrôle. Pour la surexpression d'EDTP, EDTP[GSV6] (DGRC : 202239) a été utilisé, sous le contrôle d'Appl-Gal4 (BDSC : 32040). EDTP[MI008496] (BDSC : 44782) a été utilisé comme allèle hypomorphe.

Animaux de w[1118] ; 3xmCherry-Atg8 és w[1118] ; + ; Les génotypes UAS-GFP-Lamp1 ont été fournis par Gábor Juhász (Eötvös Loránd University Budapest, Hongrie). Pour les tests de durée de vie, y[1] v[1], Appl-Gal4 ; EDTP TRiP /tubGal80[ts] et y[1] sc[*]v[1], Appl-Gal4 ; Les animaux eGFP TRiP /tubGal80[ts] (contrôle) ont été créés en croisant Appl-Gal4, tubGal80[ts];TM2/TM6B (BDSC : 7108), eGFPTRIP (V22) (BDSC : 41550) et EDTP TRIP (V22) (BDSC : 41633) animaux. Dans le cas d'un autre test de durée de vie, et pour les tests d'escalade, les animaux avec w[1118]/+ ; + ; pleGal4/+ et w[*]/+ ; + ; Les génotypes UAS-EDTP-RNAi/pleGal4 ont été créés en croisant pleGal4 (BDSC : 8848), w[1118], eGFPTRiP (V22), EDTP TRiP (V22) et w[*] ; Animaux UAS-EDTP-RNAi (III), qui étaient un don de Tamás Lukácsovich (Département de biologie du développement et cellulaire, Université de Californie, Irvine, CA, États-Unis) et décrits dans Manzéger et al.47. Les mouches ont été maintenues à 29 °C et les animaux morts ont été comptés quotidiennement.

Pour les mesures de la durée de vie, les tests d'escalade et les tests d'ubiquitination des protéines, deux constructions ARNi différentes ont été utilisées pour réguler négativement l'expression de l'EDTP. BDSC : 41633 (EDTP-ARNi (V22)) contient une séquence cible plus courte : CAG TAG TGT AAT AGT AAT CAA (Fig. S2B), tandis que l'autre construction (EDTP-ARNdsARN) contient une séquence cible plus longue mais différente (Fig. S2B) : ctc gag GGT ACC GGG AAA TGG ACT CTT CGG GCA AGT TGG GGG AGT GGG AGG TGG AGG CTC CTC GGG AAC AAC CGC CAC TGC CAC GCC TCT GAA CAG CAG TGC AGG AAG CAC CGG AAG TGA GGG TGT GGG CAT CCA AGC CTT TGT GAC CTT TGC CAA TCC CCT GCA GAC GCA ACA ACA GCA TCC GCT CCA GCA ACA ATA TCC CTC GCA GCA GAT GCA TCC CCT CCA CGC GCA ATA TCC CTC CCA GCA GCC ACA TCC ACT CCA GCA GCA GCA GCA GCA GCC ATC GCA ACA GCA ACC ACA AAA TAC GAT ATA CGA GGA TCA GTA TGA TAT CCA GCG AAT GCG GGA ATT GGT AAC GAT GGC CAA ATA TGC GAG ATG CCG TCA AAG ATT CGC CGT GCC TGT GAT TAT GTA TCG CGG AAA GTA CAT ATG CCG CTC TGC CAC GCT ATC CGT CAT GCC AGA AAC CTA CGG CCG AAA AGT GGT GGA CTA TGC CTA CGA CTG CCT GAG TGG CGG CAA TTA CAC CGC GCC AAA CGG AGA AGA GAA CGA TGC TGA CTC CAC GGA CGA GTC GCT GAT CAC CCA CAT GCA CGA CCA GGC GCA GTC GCA GTT CAG CTA CGA CGA AGT CAT CAA GAG TGA CAT CCA GCT GCT GCA TAC GCT CAA TGT CTC AAC CAT TGT GGA CCT CAT GGT CGA AAA CCG CAA AAT CAA ATA CTT CAT GGC aga tct.

Pour étudier l'expression EDTP, y[1] w[*] ; Mi{Trojan-GAL4.0}EDTP[MI08496-TG4.0]/ P{y[+ t7.7] w[+ mC] = 10XUAS-IVS-myr::GFP}su(Hw)attP5 et y[1 ] w[*] ; Mi{Trojan-GAL4.0}EDTP[MI08496-TG4.0]/ P{w[+ mC] = UAS-GFP.nls}14 animaux ont été créés en croisant EDTP TrojanGal4 (BDSC : 66899), UAS-myrGFP (BDSC : 32199) et UAS-GFPnls (BDSC : 4775). Pour mesurer les structures autophagiques marquées mCherry-Atg8a, le transgène UAS-mCherry-Atg8a a été appliqué, gracieusement fourni par Gábor Juhász (Département d'anatomie, biologie cellulaire et développementale; Université Eötvös Loránd, Budapest, Hongrie) et décrit dans la réf.48.

Pour déterminer les niveaux d'Atg8a, une construction de rapporteur GFP-Atg8a (p-Atg8a-eGFP-Atg8a) a été utilisée31. Les échantillons ont été préfixés avec du formaldéhyde à 4 % (résolu dans du PBS) et lavés trois fois (pendant 10 min) dans du PBS. Les noyaux ont été colorés avec 50 µg de Hoechst dans une solution de couverture glycérol:PBS (4:1). Pendant la mesure, nous avons utilisé le même temps d'exposition et le même grossissement pour tous les échantillons.

La fixation et l'immunohistochimie ont été réalisées selon la Réf.46. Les anticorps suivants ont été utilisés : anti-Ref(2)P 1:200, lapin—un don de Gábor Juhász, Département d'anatomie, biologie cellulaire et développementale, Université Eötvös Loránd, Budapest, Hongrie49 et anti-Atg5 (1:500 , lapin, Sigma Aldrich, AV54267), anti-Ubiquitine (1:500, souris, Merck, ST1200). Les anticorps secondaires suivants ont été utilisés : anti-Rabbit Alexa Fluor 488 (1:500, Life Technologies, A11008), anti-Mouse Alexa Fluor 488 (1:500, Life Technologies, A11001). Les noyaux ont été colorés par le colorant Hoechst (0,1 mg/ml, Molecular Probes, 33342).

Les images fluorescentes ont été capturées avec un microscope droit Zeiss Axioimager Z1 (avec objectifs Plan-NeoFluar 10 × 0,3 NA, Plan-NeoFluar 40 × 0,75 NA et Plan-Apochromat 63 × 1,4 NA) équipé d'ApoTome, et un microscope confocal Nikon C2 (avec objectif 60 × Plan Pétrolier APO VC NA = 1,45). Les logiciels AxioVision 4.82 et Jmage J 1.52c ont été utilisés pour examiner et évaluer les données obtenues. Nous avons calculé les coefficients de Pearson par l'image J 1.52c, pour évaluer la colocalisation des particules mCherry-Atg8a et GFP-Lamp1.

Des échantillons de Western blot ont été préparés à partir de 10 têtes femelles, qui ont été traitées dans 32 μl de tampon Fly Lysis + 32 μl de tampon 2 × Laemmli. Des échantillons de 15 µl ont été passés sur du gel Mini-PROTEAN® TGX™ 4–20 % et transférés sur une membrane de nitrocellulose (Kisker Biotech, 40520100). Après blocage avec du lait en poudre à 3 % (BioRad 170-6404 /Blotting-Grade Blocker/) dissous dans du TBST, les membranes ont été sondées avec des anticorps spécifiques [anti-tubuline (1:1000, souris, Sigma T6199), anti-Ref(2) P (1:2000, lapin48), anti-Atg8a (1:2500, lapin50), anti-EDTP, 1:1000, rat22, anti-souris IgG phosphatase alcaline (1:1000, Sigma, A8438) et anti-lapin Phosphatase alcaline IgG (1:1000, Sigma, A3687), phosphatase alcaline IgG anti-rat (1:1000, Sigma, A5153) et développée par la solution NBT-BCIP (Sigma, 72091). Chaque analyse Western blot a été répétée au moins trois fois avec des échantillons biologiques indépendants.

L'isolement de l'ARNm total des têtes de mouches adultes à l'âge de 1, 10, 20, 30, 40, 50 et 60 jours a été réalisé selon le protocole du kit Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research, R2050), puis l'ADNc a été généré par RevertAid RT Reverse Transcription Kit (Thermo Scientific, K1691). Les réactions PCR quantitatives en temps réel ont été réalisées dans un instrument Roche LightCycler 96 (Roche Molecular Systems) avec le kit FastStat Essential DNS Green Master (Roche, 06924204011). Les mesures quantitatives ont été répétées trois fois en utilisant des échantillons nouvellement isolés, et chaque expérience qPCR contenait trois répétitions techniques. Le niveau d'ARNm de GAPDH a été utilisé comme contrôle interne. Les amorces sens (F) et antisens (R) étaient les suivantes : EDTP F : 5′-AAA AAG CTC CGG GAA AAG G-3′ et R : 5′-AAT TCC GAT CTT CGA CAT GGC-3′, GAPDH F : 5'-TAC TTC ATG GCC GTT TCC TC-3' et R : 5'-AGA TCC CAA TCC CGG TAC TC-3'.

L'ADN génomique a été isolé de la drosophile à différents stades adultes selon des protocoles standard (Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kits #K0721 et #K0722). Les échantillons ont été digérés avec DpnI à 37 ° C pendant 20 min, puis l'enzyme a été inactivée à 80 ° C pendant 20 min, puis une expérience PCR a été réalisée comme décrit précédemment par Yao et al.42. Les amorces sens et antisens et les conditions de PCR étaient les suivantes. Pour la Drosophile, contrôle : 5′-TGA GGA ACA TCA TTC TTG GCT C-3′ et 5′-CTA CGG GGA GCT GAT GTA CT-3′ ; 6mA EDTP : 5′-ACC GTT AGG TCA GAT CTA TCC AG-3′ et 5′-CTA CGG GGA GCT GAT GTA CT-3′. PCR : 95 °C pendant 30 s, puis 95 °C pendant 10 s et 58,8 °C pendant 30 s répétés par 30/50 cycles (contrôle/échantillon).

20 mouches adultes (qui ont été élevées à 29 ° C) exprimant le transgène sous le contrôle du pilote pleGal4 ont été anesthésiées et placées dans une colonne de verre verticale (longueur, 25 cm; diamètre, 1, 5 cm). Après 1 h de période de récupération après exposition au CO2, les mouches ont été doucement frappées 5 fois au fond de la colonne. Le nombre de mouches qui ont atteint la ligne à 21,8 cm de hauteur en 20 s a été compté. Trois séries de deux mesures parallèles ont été effectuées dans chaque expérience. Les scores représentent le nombre moyen de mouches qui ont atteint le sommet par rapport au nombre total testé. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SD

Pour les mesures de la durée de vie, un nombre équivalent d'hommes et de femmes a été utilisé. Les animaux ont été transférés dans des flacons frais contenant des nutriments tous les deux jours. Le nombre d'animaux morts a été compté quotidiennement. Les mesures ont été effectuées avec cinq parallèles. Les tests ont été effectués à 25 et 29 °C.

Pour l'analyse statistique des tests d'escalade, des mesures de la durée de vie (durée de vie moyenne) et de la microscopie à fluorescence, les résultats ont été déterminés à l'aide de R Studio (version 3.4.3). La distribution des échantillons (normale ou non) a été testée avec le test de Lilliefors. S'il était normal, un test F a été effectué pour comparer les variances. Dans les cas où les variances étaient égales, un test t à deux échantillons a été utilisé, sinon un test t pour des variances inégales a été appliqué. En cas de distribution non normale, le test U de Mann–Whitney a été réalisé. Pour les statistiques de la courbe de durée de vie, la méthode du logrank (Mantel-Cox) a été utilisée, calculée avec le programme SPSS17.0.

Des protéines ubiquitinées dans la voie autophagique-endocytotique et une altération de l'autophagie ont été observées par localisation immunohistochimique de l'anticorps MTMR14 anti-myotubularin-related phosphatase, respectivement. Après déparaffinage et réhydratation, les coupes ont été bouillies dans une solution de tampon citrate 0,01 M (pH 6,0) dans un four à micro-ondes pendant 2 min (réglé à 900 watts) pour la récupération de l'antigène. Après avoir bloqué la peroxydase endogène dans du TBS 0,1 M contenant 3 % de H2O2 pendant 10 min à 37 °C, les coupes ont été lavées pendant 3 à 5 min dans du TBS 0,1 M (pH 7,4) à température ambiante. Les coupes de tissus ont ensuite été perméabilisées et la liaison de fond des anticorps a été réduite dans une solution de blocage (0,1 M TBS contenant 5 % de sérum de chèvre normal, 1 % de BSA, 0,05 % de Triton X-100) pendant 30 min à 37 °C. Les sections ont été recouvertes de la solution ci-dessus contenant soit l'anticorps primaire anti-NeuN de souris (dilution finale 1:500 ; Chemicon, Billerica, MA, États-Unis), soit l'anticorps primaire polyclonal anti-MTMR14 de lapin (dilution finale 1:100 ; ab102575, Abcam, Cambridge , Royaume-Uni) pendant une nuit à 4 °C. Après incubation avec les anticorps primaires, les coupes ont été lavées pendant 4 × 5 min dans du TBS 0, 1 M (pH 7, 4) à température ambiante. Des expériences de contrôle négatif ont été réalisées lorsque l'anticorps primaire approprié a été omis. Les sections ont ensuite été traitées avec un anticorps secondaire biotinylé anti-lapin ou anti-IgG de souris (dilution finale 1:200 ; Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, Angleterre) dans une solution de blocage (où le Triton X-100 a été omis) pendant 5 h à RT. Après plusieurs lavages (4 × 5 min), un anticorps tertiaire streptavidine-peroxydase biotinylé (dilution finale 1: 200; Amersham) dans une solution de blocage (sans Triton X-100) a été appliqué sur les coupes pendant une nuit à 4 ° C. Les sections ont été lavées à nouveau dans du TBS 0, 1 M (pH 7, 4) pendant 4 × 5 min à température ambiante et traitées pour l'histochimie de l'enzyme peroxydase à l'aide de Sigma Fast DAB Tablet (Sigma, St. Louis, MO, USA) selon le protocole du fabricant. Les coupes ont été lavées pendant 3 × 5 min dans du TBS 0,1 M (pH 7,4) à température ambiante, rincées à l'eau distillée pendant 1 min, déshydratées dans une série de solutions d'éthanol, recouvertes de milieu de montage DPX (Fluka, 30 Buchs, Suisse) et recouvertes d'une lamelle .

Des images numériques de sections de cortex temporal de 4 sujets non déments (voir le tableau S4 pour les âges, les sexes, les délais post-mortem et les stades de Braak) immunocolorés pour NeuN ont été prises avec un microscope optique Leica DMLB (Leica Microskopie und Systeme GmbH ; Wetzlar, Allemagne) à l'aide d'un appareil photo numérique Qimage MicroPublisher 3.3 RTV (Surrey, BC, Canada). Les cellules NeuN-positives (non représentées) ont été comptées à l'aide du programme informatique ImageJ (version 1.47; développé par W. Rasband aux National Institutes of Health des États-Unis et disponible sur Internet à http://rsb.info.nih. gov/ij) comme nous l'avons publié précédemment (pour plus de détails, voir les références 35, 51. Les immunoréactivités de MTMR14 ont été quantifiées dans le cytoplasme sans lipofuscine grâce à l'utilisation du logiciel de traitement d'image ImageJ. Un total de 134 cellules provenant d'échantillons non déments ont été analysées. Mesures ont été prises par deux enquêteurs indépendants et les valeurs de densité ont été moyennées.

La distribution des protéines a été mesurée à l'aide de techniques d'immunofluorescence, en utilisant la méthode d'amplification du signal fluorophore‐tyramide (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Un automate de coloration BOND-RX (Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne) a été utilisé pour préparer les lames pour la coloration. Les coupes ont été « cuites » (30 min à 60 °C), déparaffinées à l'aide de la solution Bond Dewax (Leica Biosystems, 72 °C) et soumises à une étape de récupération d'épitope induite par la chaleur (solution à base d'EDTA, pH 9,0, 20 min à 100 °C).

Après ce "prétraitement", les lames ont été lavées manuellement dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), incubées dans 0,03 % de H2O2 pendant 30 min pour bloquer la peroxydase endogène, puis lavées à nouveau. Anticorps primaire de lapin dirigé contre le SQSTM1 humain (HPA003196, Atlas Antibodies, Stockholm, Suède) dilué au 1:10 dans un tampon d'anticorps primaire (0,3 % TX‐100, 0,1 % NaN3, PBS) et ajouté aux lames pour une incubation d'une nuit dans une chambre humidifiée à 4 °C. Le jour suivant, les lames ont été lavées dans une solution saline tamponnée Tris (TBS, pH 7,4)–Tween 20, et bloquées dans un tampon de blocage Tris‐NaCl (TNB) (0,1 mol/L Tris‐HCl, pH 7,5, 0,15 mol/L NaCl , réactif de blocage à 0,5 %, Perkin Elmer) pendant 30 min. Les anticorps conjugués HRP de porc anti-lapin secondaires (DAKO) dilués au 1:200 dans du TNB ont ensuite été appliqués sur les lames pendant 30 min, suivis d'un lavage dans du TBS-Tween 20. Pour le signal tyramide, les lames d'amplification ont été incubées avec du tyramide conjugué à la fluorescéine. dilué (1:100) dans un réactif d'amplification (Perkin Elmer) pendant 15 min à température ambiante.

Pour éteindre l'autofluorescence de la lipofuscine dans le tissu, les lames ont été contre-colorées avec une solution lipophile de noir du Soudan B (1 % p/v dans de l'éthanol à 70 %, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) pendant 5 min. Les lames ont ensuite été plongées dans de l'éthanol à 70 %, suivies d'un lavage au PBS et recouvertes d'une lamelle à l'aide d'un milieu de montage aqueux contenant un contre-colorant de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Sauf indication contraire, toutes les étapes ont été exécutées à température ambiante.

Les images ont été acquises sur un système automatisé de numérisation de diapositives VSlide (Metasystems, Altlussheim, Allemagne). Des morceaux entiers de tissu sur les lames ont été imagés avec un objectif 20 × (NA = 0,45, résolution 3,6 pixels/μm). Chaque champ de vision a été capturé à 3 niveaux z avec un intervalle de 1 μm pour créer une image à mise au point étendue. Les images du champ de vision acquises ont été assemblées pour créer une vue d'ensemble complète avec une résolution microscopique. Les spectres d'émission pour les anticorps secondaires conjugués au fluorophore étaient les suivants : Hoechst (420–485 nm), Cy2 (490–530 nm), Cy3 (550–570 nm), Cy3.5 (580–595 nm) et Cy5 (650–670 nm).

Des échantillons d'ARNm humains totaux ont été isolés des tissus corticaux temporaux selon le protocole du kit Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research, R2050), puis l'ADNc a été généré par le kit de transcription inverse RevertAid RT (Thermo Scientific, K1691). L'instrument Roche LightCycler 96 (Roche Molecular Systems) avec le kit FastStat Essential DNS Green Master (Roche, 06924204011) a été utilisé pour les réactions PCR quantitatives en temps réel. GAPDH a été utilisé comme contrôle interne. Les amorces sens et antisens suivantes ont été utilisées : GAPDH : 5′-TCG GAG TCA ACG ATT TGG T-3′ et 5′-TTC CCG TTC TCA GCC TTG AC-3′, MTMR14 : 5′-GTA ACG GGC TGT GGC AGT AT-3′ et 5′-TTC CCG TTC TCA GCC TTG AC-3′.

Les protéines ont été isolées des tissus corticaux temporaux selon le protocole standard de préparation d'échantillons pour Western blot d'Abcam. 15 mg de tissu ont été homogénéisés pour chaque échantillon dans 600 µl de tampon de lyse (incluant le tampon RIPA et les inhibiteurs de protéase et de phosphatase) avec un homogénéisateur électrique. Des échantillons de 20 µl ont été passés sur du gel Mini-PROTEAN® TGX™ 4–20 % et transférés sur une membrane de nitrocellulose (Kisker Biotech, 40520100). Après blocage avec du lait en poudre à 3 % (BioRad 170-6404 /Blotting-Grade Blocker/) dissous dans du TBST, les membranes ont été sondées avec des anticorps spécifiques [anti-GAPDH (1 :2000, lapin, Sigma G9545), anti-MTMR14 (1 : 500, lapin, Abcam ab102575), anti-lapin IgG phosphatase alcaline (1:1000, Sigma, A3687), et développé par la solution NBT-BCIP (Sigma, 72091).

Le tissu cortical temporal humain témoin a été obtenu à partir de cinq hommes et d'une femme (SKO20 : 27 ans, SKO7 : 55 ans, SKO19 : 61 ans, SKO11 : 77 ans, SKO16 : 72- ans, SKO18 : 85 ans) les sujets sont décédés de causes non liées à une maladie cérébrale et n'avaient aucun antécédent de trouble neurologique. Les sujets témoins ont été traités pour l'autopsie au Département de pathologie, Hôpital Saint Borbála, Tatabánya, Hongrie. Les tissus ont été obtenus et utilisés conformément à la Déclaration d'Helsinki. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité régional et institutionnel d'éthique des sciences et de la recherche du Conseil scientifique de la santé, conformément à la loi hongroise (ETT TUKEB 15032/2019/EKU).

Des échantillons de cerveau ont été prélevés 2 à 4, 5 h après la mort, les artères carotides internes et vertébrales ont été canulées et ont d'abord été perfusées avec du sérum physiologique (1,5 l en 30 min) contenant 5 ml d'héparine, suivi d'une solution fixatrice contenant 4% paraformaldéhyde, 0,05% de glutaraldéhyde et 0,2% d'acide picrique dans du PB 0,1 M, pH 7,4 (4–5 l en 1,5–2 h). Le cortex temporal a été retiré après perfusion et post-fixé dans la même solution de fixateur pendant la nuit, mais sans glutaraldéhyde52. Ensuite, des sections coronales de 60 µm d'épaisseur ont été préparées à partir des blocs avec un vibratome Leica VTS-1000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne) pour l'immunohistochimie. Les coupes ont été lavées dans du PB et immergées dans du saccharose à 30 % pendant 1 à 2 jours, puis congelées-décongelées trois fois sur de l'azote liquide. Les sections ont été traitées pour l'immunocoloration comme suit : après avoir été soigneusement lavées dans du PB cinq fois, l'activité de la peroxydase endogène a été bloquée par 1 % de H2O2 dans une solution saline tamponnée au TRIS (TBS, pH 7,4) pendant 10 minutes. Le TBS a été utilisé pour tous les lavages (3 × 10 min entre chaque antisérum) et pour la dilution des antisérums. Pour les investigations microscopiques confocales, l'incubation des anticorps primaires s'est produite simultanément (anti-MTMR14, lapin, 1:500 ; ABCAM, #ab102575), anti-NeuN, souris, 1:2000 ; Merck, #Ab377). Après incubation, des anticorps secondaires avec des fluorophores ont été appliqués (DAM Alexa488 1:500 ; Thermofisher, #A-2107, DAR Alexa594 1:500 ; Thermofisher, #A-2102) pendant 3 h, puis les échantillons ont été incubés avec du fluorophore DAPI (1 : 10 000, Sigma-Aldrich, #D9564) pendant 2 h. Pour réduire l'autofluorescence, les échantillons ont été incubés avec une solution de CuSO4 pendant 40 min ou les échantillons ont été traités avec AER (Autofluorescence Eliminator Reagent; Merck, #2160) dans de l'éthanol à 70 % pendant 5 min. Après cela, les échantillons ont été montés dans Aqua-Poly/Mount (Polysciences, #18606-20). Pour éviter toute interaction avec des produits chimiques supplémentaires provoquant une intensité fluorescente réduite, une mesure quantitative a été effectuée sans AER. Les échantillons ont été analysés à l'aide d'un microscope fluorescent confocal Nikon C2 avec des objectifs à huile 60 ×. Les zones ROI (région d'intérêt) ont été définies à partir de la largeur totale de la couche corticale 3 à partir de sections corticales temporelles (zone de Brodmann 38). Les cellules marquées au NeunN ont été photographiées dans leur plus grande étendue péricaryale. Avec cette méthode, env. 30 cellules ont été photographiées à partir de la couche 3d de chaque échantillon cortical. Les images confocales triple fluorescence NeuNm/MTMR14r/DAPI ont été analysées par le programme ImageJ 1.50b. Lors des mesures, les trois canaux (vert : 488 nm ; rouge : 594 nm ; bleu : DAPI 470 nm) ont été visualisés séparément. Les zones de cytoplasme sans noyau ou lipofuscine autofluorescente ont été déterminées à l'aide des canaux NeuN (vert) et DAPI (bleu). Dans ces cellules, une ou deux zones ROI de 2 à 4 µm2 ont été désignées. L'intensité a été mesurée dans les zones ROI dans le canal rouge correspondant à l'immunomarquage MTMR14. Bien que les paramètres d'imagerie soient uniformes, les valeurs d'intensité absolues n'étaient pas comparables en raison des différences individuelles dans les échantillons, de sorte qu'une unité d'intensité relative (UI) a été déterminée pour chaque cellule individuelle. Comme intensité de référence, l'intensité relative (mesurée comme décrit ci-dessus) des cellules gliales adjacentes aux neurones a été utilisée. L'intensité relative a été calculée selon la formule suivante : UI = (AI-RI)/(MI-RI) × 100, où AI est l'intensité absolue mesurée dans le cytoplasme des neurones, RI est l'intensité de référence, MI est la plus élevée intensité trouvée dans l'image. Pour les images sans cellules gliales identifiables, la moyenne des valeurs RI des images du sujet a été utilisée pour le calcul. Pour les statistiques, les diagrammes Statistica 13.4 du programme Microsoft Excell ont été utilisés. Les six sujets ont été divisés en deux groupes, comme "jeunes" contenant les sujets de 27, 55 et 61 ans contre "vieux" contenant les sujets de 72, 77 et 85 ans. La normalité des valeurs UI obtenues a été vérifiée par le test de Kolmogorov-Smirnov. Sur la base des valeurs de P > 0,2, les données étaient normalement distribuées, de sorte que les données unitaires d'intensité regroupées des deux groupes ont été comparées par test T.

L'ARN total a été isolé à partir d'échantillons corticaux frontaux canins stockés congelés dans RNAlater (Thermo Fisher Scientific, # AM7021), en utilisant TRIzol (ThermoFisher Scientific, # 15596018), conformément aux instructions du fabricant. Avant d'immerger les morceaux de tissu dans du TRIzol, chaque morceau a été rincé dans 1 ml de PBS stérile dans un nouveau tube et centrifugé pendant 5 min à 500 g. TRIzol a été ajouté aux échantillons après avoir retiré le PBS. Des morceaux de tissu ont été homogénéisés dans du TRIzol par un homogénéisateur Ultra-Turrax (Ika). Après homogénéisation, l'isolement de l'ARN a eu lieu. La qualité des isolats a été vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose et les concentrations ont été mesurées par un appareil NanoDrop (ThermoFisher Scientific). Les échantillons d'ARN isolés ont été stockés à - 20 ° C avant la synthèse de l'ADNc et à - 80 ° C pour le stockage à long terme.

1000 ng d'ARN total ont été rétrotranscrits en ADNc, en utilisant le kit de synthèse d'ADNc Maxima RevertAid (Thermo Fisher Scientific, #K1672). Une transcription inverse a été effectuée en utilisant des amorces hexamères aléatoires. Ensuite, les échantillons d'ADNc ont été dilués dix fois dans de l'eau sans nucléase et conservés soit à - 20 ° C, soit à - 80 ° C. Des réactions de PCR quantitatives en temps réel ont été réalisées dans un instrument Roche LightCycler 96 (Roche Molecular Systems), en utilisant des dosages commerciaux TaqMan et un mélange maître TaqMan Gene Expression (Thermo Fisher Scientific, #4369514). Les orthologues canins de MTMR14 et GAPDH (contrôle interne) sont respectivement Cf02682018_g1 et Cf04419463_gH. Les réactions ont été réalisées en triple dans des plaques à 96 puits.

Les procédures impliquant l'expérimentation sur des sujets animaux vertébrés ont été réalisées conformément au guide de l'Université Eötvös Loránd, Budapest, Hongrie. Nous confirmons que les études présentées dans le manuscrit ont été réalisées conformément aux directives ARRIVE.

La manipulation d'échantillons de cerveaux d'animaux et d'humains a été effectuée conformément aux directives du Comité sur l'expérimentation humaine de l'Université de Szeged, de la Faculté de médecine et de la Faculté des sciences et de l'informatique (Szeged, Hongrie), ainsi que de l'Institut de médecine expérimentale de l'Académie hongroise des sciences. (Budapest, Hongrie), dans lequel les expériences ont été réalisées. Nous confirmons qu'un consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets et/ou de leur tuteur légal (pour l'utilisation de leurs données dans notre manuscrit).

La manipulation d'échantillons de cerveaux d'animaux et d'humains a été effectuée conformément aux directives du Comité sur l'expérimentation humaine de l'Université de Szeged, de la Faculté de médecine et de la Faculté des sciences et de l'informatique (Szeged, Hongrie), ainsi que de l'Institut de médecine expérimentale de l'Académie hongroise des sciences. (Budapest, Hongrie), dans lequel les expériences ont été réalisées. Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Liés à l'autophagie

Coiled-coil, protéine interagissant avec BCL2 de type myosine

Phosphatase dérivée de l'œuf

Fab 1 (orthologue de levure de PIKfyve) YOTB, Vac 1 (protéine de transport des vésicules) et EEA1

Protéine fluorescente verte

Facteur de croissance analogue à l'insuline

Protéines associées aux microtubules 1A/1B chaîne légère 3B

Myotubularine

Lié à la myotubularine

Phosphatidylinositol

Phosphatidylinositol 3-kinase de classe III

Phosphatidylinositol 3-phosphate

Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate

Rubicon (domaine RUN et domaine riche en cystéine contenant la protéine interagissant avec Beclin 1)

Séquestosome 1

Cible de la rapamycine

Gène associé à la résistance aux rayonnements ultraviolets

Tri des protéines vacuolaires 34

N6-méthyladénine

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Ce travail a été soutenu par les subventions OTKA (Hungarian Scientific Research Fund) K109349 et K132439 à TV, MEDinPROT Protein Science Research Synergy Program (fourni par l'Académie hongroise des sciences ; HAS) à TV, l'Union européenne et l'État de Hongrie, co -financé par le Fonds européen de développement régional (VEKOP-2.3.2-16-2017-00014) à TV, GINOP 2.3.2-15-2016-00034 à KG, ERC Starting (680040) et Bolyai (HAS) à EK. et Programme national de recherche sur le cerveau (2017-1.2.1-NKP-2017-00002) à ZM. L'étude a été soutenue par l'Académie hongroise des sciences via une subvention au groupe de recherche sur les animaux de compagnie MTA-ELTE 'Lendület/Momentum' (subvention n° PH1404/21) et le National Brain Program 3.0 (NAP2022-I-3/2022) à EK. VB et TV ont été soutenus par le groupe de recherche génétique ELKH-ELTE (01062). Ce travail a été réalisé dans le cadre du programme d'excellence institutionnelle ELTE soutenu par le Bureau national de la recherche, du développement et de l'innovation (NKFIH-1157-8/2019-DT). MP a été soutenu par le programme hongrois de recherche sur le cerveau (2017-1.2.1. NKP-2017-00002). Des tissus humains ont été partiellement fournis par l'hôpital Saint Borbala, Tatabánya, Hongrie, et le Laboratoire de recherche sur le cerveau humain, Institut de médecine expérimentale, HAS, Budapest, Hongrie.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Tibor Kovács et Janka Szinyákovics.

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Tibor Kovács, Janka Szinyakovics, Viktor Billes, Gábor Murányi, Virginia B. Varga & Tibor Vellai

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Eniko Kubinyi

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TK a conçu et réalisé des expériences sur la drosophile et des échantillons humains, analysé les données et rédigé le manuscrit ; JS a réalisé des expériences sur la drosophile et des échantillons humains, a analysé les données ; VB a réalisé diverses expériences sur la drosophile, GM a été impliqué dans l'analyse de l'expression de l'EDTP ; VBV a réalisé des expériences sur la drosophile ; AB, Á.L. et MS a effectué l'analyse de l'expression de p62 et MTMR14 dans des échantillons de cerveau humain ; SS a effectué l'analyse de l'expression de MTMR14 dans des échantillons de cerveau de chien ; CS-P. et PS a effectué la quantification des niveaux d'accumulation de MTMR dans des échantillons de cerveau humain ; JL a fourni et analysé des échantillons de tissus cérébraux humains ; MP et ER ont effectué une microdissection des zones corticales cérébrales humaines ; JM a effectué l'analyse de l'accumulation de p62 dans des échantillons de cerveau humain post-mortem ; EK, BG, KG, ZM et TV ont conçu des expériences, analysé des données et rédigé le manuscrit.

Correspondance à Károly Gulya, Zsófia Maglóczky ou Tibor Vellai.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Kovács, T., Szinyákovics, J., Billes, V. et al. Une phosphatase lipidique MTMR conservée supprime de plus en plus l'autophagie dans les neurones du cerveau au cours du vieillissement. Sci Rep 12, 21817 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24843-w

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Reçu : 01 décembre 2021

Accepté : 21 novembre 2022

Publié: 17 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-24843-w

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