ACSS2

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 1483 (2023) Citer cet article

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L'alkaliptose est un type de mort cellulaire dépendant du pH récemment découvert et utilisé pour le traitement des tumeurs. Cependant, ses mécanismes moléculaires sous-jacents et ses réseaux de régulation sont largement inconnus. Nous rapportons ici que le membre de la famille 2 (ACSS2) de la famille des synthétase à chaîne courte acétyl-CoA de l'enzyme activant l'acétate est un régulateur positif de l'alkaliptose dans les cellules humaines de l'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC). À l'aide de la qPCR et de l'analyse Western blot, nous avons constaté que l'expression de l'ARNm et des protéines d'ACSS2 était régulée positivement dans les lignées cellulaires humaines PDAC (PANC1 et MiaPaCa2) en réponse à l'activateur d'alkaliptose classique JTC801. Par conséquent, l'inactivation d'ACSS2 par les shARN a inhibé la mort cellulaire induite par JTC801 dans les cellules PDAC et s'est accompagnée d'une augmentation de la formation de clones cellulaires et d'une diminution du pH intracellulaire. Mécaniquement, la production d'acétyl-coenzyme A médiée par ACSS2 et l'acétylation ultérieure des histones ont contribué à la régulation négative de CA9 dépendante de NF-κB, et cet effet a été renforcé par l'inhibiteur de l'histone désacétylase, la trichostatine A. Ces résultats peuvent fournir de nouvelles informations pour comprendre la base métabolique de l'alkaliptose. et établir une stratégie potentielle pour le traitement PDAC.

Il existe de nombreux types différents de mort cellulaire régulée (RCD), qui présentent des caractéristiques morphologiques, biochimiques et génétiques importantes1. L'apoptose est la forme la plus étudiée de RCD. Elle implique la formation de corps apoptotiques liés à la membrane et est généralement médiée par la famille des caspases. Cependant, la résistance à l'apoptose reste un défi clinique majeur pour le traitement du cancer2. Récemment, plusieurs formes de mort cellulaire non apoptotique ont été rapportées pour surmonter la tolérance apoptotique pour traiter divers types de cancer3. Parmi eux, l'alkaliptose est un RCD dépendant du pH qui a été identifié pour la première fois par le dépistage de médicaments pour tuer les cellules d'adénocarcinome canalaire pancréatique humain (PDAC)4. Le composé à petite molécule JTC801 est actuellement un inducteur typique de l'alkaliptose, qui repose sur l'activation du facteur nucléaire kappa B (NF-κB), remplissant plutôt sa fonction bien connue d'antagoniste sélectif des récepteurs peptidiques de la douleur4. L'activation de NF-κB médiée par JTC801 inhibe l'expression de l'anhydrase carbonique 9 (CA9), dont le produit régule l'équilibre du pH et conduit finalement à une alkaliptose avec rupture de la membrane plasmique4. Une meilleure compréhension du mécanisme et de la régulation de l'homéostasie du pH peut améliorer l'activité anticancéreuse de la thérapie basée sur l'alkaliptose5.

L'acétyl-coenzyme A (AcCoA) est un métabolite qui joue un rôle central dans la production d'énergie, le métabolisme des lipides et la modification de l'épigénome6. L'homéostasie de l'AcCoA affecte directement le niveau d'acétylation des histones, régulant ainsi l'expression des gènes7. L'AcCoA est généralement produite par deux voies6. L'un est médié par l'ATP citrate lyase (ACLY), qui clive l'acide citrique en oxaloacétate et acétyl-CoA. L'autre est médiée par la famille de l'acétyl-CoA synthase à chaîne courte (ACSS), qui ligature l'acétate et le CoA. La famille ACSS comprend ACSS1, ACSS2 et ACSS3, qui ont des emplacements et des fonctions subcellulaires différents. ACSS1 et ACSS3 sont principalement localisés dans les mitochondries et participent à la phosphorylation oxydative mitochondriale, tandis que ACSS2 est principalement localisé dans le noyau et le cytoplasme8. L'ACSS2 nucléaire récupère l'acétate libéré par la désacétylation des histones pour le recycler par l'histone acétyltransférase9. ACSS2 utilise l'acétate pour fournir l'AcCoA pour la lipogenèse de novo et l'acétylation des histones10. Bien que l'ACSS joue un rôle dans la régulation de la survie et de l'apoptose de diverses cellules cancéreuses11,12, son rôle dans l'alkaliptose est encore incertain.

Dans cette étude, nous identifions un nouveau rôle d'ACSS2 dans la médiation de l'alkaliptose dans les cellules PDAC humaines en maintenant l'activation de NF-κB et en régulant ensuite à la hausse le pH intracellulaire par l'acétylation des histones. Ces résultats renforcent l'idée que des signaux cancérigènes ou pro-survie peuvent être utilisés pour déclencher la mort cellulaire.

Les anticorps contre ACSS2 (3658), GAPDH (5174), p-IKKα/β (2697), IKKα (11930), p-NF-κB (3033), IKBα (7217), acetylated-lysine (9814), IKKβ ( 8943), NF-κB (16502), p-IKBα (2859) et CA9 (5648) ont été obtenus auprès de Cell Signaling Technology. L'anticorps anti-PARP (13371-1-1-ap) a été obtenu auprès de Proteintech. JTC801 (S272201) a été acheté chez Selleck Chemicals. La staurosporine (62996-74-1) et la trichostatine A (58880-19-6) ont été achetées chez MedChemExpress.

Les lignées cellulaires PANC1 (CRL-1469), MiaPaCa2 (CRL-1420) et CFPAC-1 (CRL-1918) ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection. Les cellules ont été cultivées dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco avec 10 % de sérum bovin fœtal, 2 mM de l-glutamine et 100 U/ml de pénicilline et de streptomycine. La culture cellulaire a été placée dans un incubateur à 37°C avec 5% de dioxyde de carbone. Les lignées cellulaires ont été validées par de courts profils répétés en tandem, et les tests de mycoplasme de routine étaient négatifs pour la contamination. Le diméthylsulfoxyde (DMSO) a été utilisé pour préparer la solution mère de médicaments. La concentration finale de DMSO dans la solution de travail du médicament dans les cellules était < 0,01 %. Du DMSO à 0,01 % a été utilisé comme véhicule témoin dans tous les tests de culture cellulaire13.

L'hybridation du réseau a été réalisée selon le protocole d'analyse de l'expression génique basé sur un microréseau à une seule couleur d'Agilent (Agilent Technology)14. La quantité et la qualité de l'ARN ont été mesurées par NanoDrop ND-1000. L'intégrité de l'ARN a été évaluée par électrophorèse standard sur gel d'agarose dénaturant. L'ARNm a été purifié à partir de l'ARN total après élimination de l'ARNr à l'aide du kit d'isolement d'ARNm eucaryote ARNm-ONLY (Epicentre). L'ARN total (100 ng) isolé de chaque échantillon a été converti en ADNc, fragmenté et hybridé sur des puces GeneChip. Les matrices d'hybridation ont été lavées, fixées et scannées à l'aide du scanner Agilent DNA Microarray (P/N G2505C). Le scanner GeneChip 3000 (Affymetrix) a été utilisé pour numériser et quantifier les images des puces hybrides GeneChip. La valeur d'intensité pour chaque cellule sonde dans le réseau a été calculée par le logiciel GeneChip.

L'ACSS2-shRNA-1 humain préconçu (GCTTCTGTTCTGGGTCTGAAT), l'ACSS2-shRNA-2 (CGGTTCTGCTACTTTCCCCATT) et le shRNA vide témoin (pLKO.1) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich dans un format lentiviral. Nous avons ensemencé 1 × 105 cellules dans chaque puits d'une plaque à 12 puits dans 500 μl de milieu complet et les avons transduites par des vecteurs lentiviraux à un MOI de 10: 1. La transduction a été réalisée en présence de polybrène (8 µg/ml). Après récupération avec un milieu de culture complet, la puromycine (5 µg/ml) a été utilisée pour la sélection des cellules transduites13.

Les cellules ont été lysées à 4 ° C dans un tampon RIPA glacé (9806, Cell Signaling Technology) et les lysats cellulaires ont été éliminés par une brève centrifugation (13 000 × g, 15 min, 4 ° C). Le surnageant a été utilisé pour l'immunoprécipitation avec les anticorps indiqués. Généralement, 2 mg d'anticorps ont été ajoutés au surnageant et incubés à 4 ° C pendant la nuit. Ensuite, 30 μl de suspension de protéine G ou de sépharose A ont été ajoutés et l'échantillon a été incubé pendant 2 heures supplémentaires à 4 ° C. Après incubation, les billes ont été lavées abondamment avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et les protéines ont été éluées par ébullition dans un tampon d'échantillon de dodécylsulfate de sodium 2 × avant l'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide4.

Les cellules ont été lysées 1 × dans un tampon de lyse cellulaire (Cell Signaling Technology, 9803) avec un cocktail d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase (Cell Signaling Technology, 5872) sur de la glace pendant 30 min13. Après centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min à 4 °C, les surnageants ont été collectés et quantifiés à l'aide d'un dosage à l'acide bicinchoninique (BCA) (Thermo Fisher Scientific, 23225). Les protéines de 30 µg ont été séparées sur des gels d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) à 10 % (Epizyme, PG112) et transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF) (Millipore, IPVH00010). Après blocage par du TBST contenant 5 % de lait écrémé pendant 1 h, les membranes ont été incubées pendant une nuit à 4 °C avec divers anticorps primaires (1 : 200–1 : 1 000). Après incubation avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase (anticorps secondaires de lapin anti-IgG de chèvre [Abcam, ab6741; 1:1000]) pendant 1 h à température ambiante, les signaux ont été visualisés à l'aide du substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico PLUS (Thermo Fisher Scientific, 34580 ). Les transferts ont été analysés à l'aide du système d'imagerie ChemiDoc Touch (Bio-Rad) et du logiciel Image Lab (Bio-Rad). Toutes les expériences ont été réalisées à 5 % de CO2 et en normoxie et ont été répétées au moins trois fois, les résultats représentatifs sont présentés.

Le niveau de viabilité cellulaire a été dosé à l'aide d'un kit Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (YEASEN, 40203ES80) selon le protocole du fabricant15. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (1 × 104 cellules/puits) et traitées avec les composés indiqués pendant 24 h. Pour chaque puits de la plaque, le milieu a été remplacé par 100 µl de milieu frais contenant 10 µl de solutions de CCK-8. La culture a ensuite été remise dans l'incubateur cellulaire pendant 60 à 90 min. L'absorbance à 450 nm était proportionnelle au nombre de cellules vivantes dans la culture. La viabilité cellulaire a été exprimée en niveau relatif et la viabilité cellulaire à 100 % a été fixée à 1.

Pour le test clonogénique, des cellules témoins ou traitées au JTC801 ont été ensemencées dans des plaques 12 puits (500 cellules par puits), puis le milieu a été changé une fois tous les 2 jours. Les plaques ont été incubées à 37°C pendant 3 semaines jusqu'à l'apparition de colonies. Les cellules ont ensuite été fixées avec du méthanol et les colonies ont été colorées avec du cristal violet à 0,4 %.

Les cellules ont été ensemencées à une densité de 2 × 105 cellules/puits dans du milieu dans des plaques à 6 puits. Le lendemain, les cellules ont été incubées avec les traitements indiqués. Après cela, les cellules ont été colorées avec de l'iodure de propidium (BestBio, BB-4131-1) pendant 20 à 30 min dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C. Les changements morphologiques ont été examinés à l'aide d'un microscope à fluorescence à un grossissement × 20. Un compteur de cellules automatisé Countess II FL (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé pour doser les pourcentages de cellules mortes après coloration à l'iodure de propidium. La mort cellulaire a été exprimée en niveau relatif et la mort cellulaire à 100 % a été fixée à 115.

L'ARN total a été extrait à l'aide d'un kit RNeasy Plus Micro (QIAGEN, 74034) conformément aux instructions du fabricant15. Les lysats cellulaires ont été centrifugés à l'aide des colonnes de centrifugation gDNA Eliminator du kit pour éliminer l'ADN génomique. L'ARN total a été purifié à l'aide de colonnes de centrifugation RNeasy MinElute. L'ADNc du premier brin a ensuite été synthétisé à partir de 1 µg d'ARN en utilisant PrimeScript RT Master Mix (Takara, RR036A). Ensuite, 20 µl de réactions ont été préparés en combinant 4 µl de mélange réactionnel PrimeScript RT Master, 2 µl de solution d'activateur spécifique au gène, 1 µl de transcriptase inverse, 1 µl de pool de dosage spécifique au gène (20 ×, 2 µM) et 12 µl d'ARN dilué dans de l'eau sans RNase, DNase et ADN génomique. Nous avons effectué une qPCR en utilisant TB Green Premix Ex Taq II (Takara, RR820Q) sur le système en temps réel C1000 Touch Thermocycler CFX96 (Bio-Rad). L'analyse a été effectuée à l'aide du logiciel Bio-Rad CFX Manager 2.0. Les données ont été normalisées à l'ARN GAPDH et le changement de facteur a été calculé via la méthode 2-DDCt. Les concentrations relatives d'ARNm ont été exprimées en unités arbitraires basées sur le groupe non traité, auquel on a attribué une valeur de 1.

Pour évaluer le taux d'apoptose dans les cellules WT et ACSS2 konckdown après traitement avec de la staurosporine (500 nM) ou JTC801 (3 µM) pendant 24 h, les cellules ont été collectées et à l'aide du kit de coloration Active Caspase-3/7 (Abcam, ab284532) selon les instructions du fabricant. instructions. Le pic de fluorescence de Caspase-3/7 est analysé par cytométrie en flux (BD FACSVerse, Becton,Dickinson and Company) en utilisant le canal FL-1.

Pour la coloration PI des échantillons cellulaires, les cellules ont été collectées et remises en suspension dans du tampon de liaison (BD biosciences, n° 556570), puis colorées avec de l'iodure de propidium (2 mg/ml). Les données ont été collectées et analysées dans BD FACVerse.

Le pH extracellulaire a été mesuré à l'aide d'un pH-mètre (mètre pH/OPR Seven Compact S210, instrument METTLER TOLEDO, États-Unis) conformément aux directives du fabricant. Le pH intracellulaire a été déterminé à l'aide d'une sonde indicatrice de pH cytoplasmique fluorogène (Thermo Fisher Scientific). L'intensité de fluorescence de la sonde est alors un indicateur du pH intracellulaire. Il est faiblement fluorescent à pH neutre mais de plus en plus fluorescent à mesure que le pH baisse. Ce réactif peut quantifier le pH cytosolique cellulaire dans la plage de 9 à 4 avec un pKa d'environ 6,5 avec une excitation/émission de 509/533 nm. L'utilisation ultérieure du kit de tampons d'étalonnage du pH intracellulaire (P35379) permet de quantifier ce pH intracellulaire. En bref, les cellules ont été lavées avec Live Cell Imaging Solution (LCIS), puis 10 μl de pHrodo ™ Red AM ou pHrodo ™ Green AM ont été mélangés avec 100 μl de concentré PowerLoad ™ et ont été ajoutés à 10 ml de LCIS. Les cellules ont été incubées avec le pHrodo™ AM/PowerLoad™/LCIS à 37 °C pendant 30 min, puis ont été analysées à l'aide du lecteur multimode d'imagerie cellulaire Cytation™ 5 (BioTek, USA) en utilisant le 509/533 maxima4.

L'acétyl-CoA cellulaire a été mesuré à l'aide du kit de dosage Acetyl-CoA (Sigma, MAK039) selon le protocole du fabricant. En bref, les cellules ont été additionnées d'acide perchlorique et homogénéisées. Après centrifugation (10 000 × g, 10 min, 4 ° C), 400 μl de surnageant ont été neutralisés avec 40 μl de KHCO3 saturé et centrifugés à 10 000 × g pendant 5 min à 4 ° C. Une courbe standard d'acétyl-CoA a été générée à l'aide de différentes concentrations (0 à 1 000 pmol/ml) de l'étalon d'acétyl-CoA fourni. Les valeurs de fond ont été éliminées de la norme et la concentration des échantillons a été calculée à l'aide du lecteur multimode d'imagerie cellulaire Cytation™ 5 (BioTek, États-Unis) en utilisant les maxima 535/587.

Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD, sauf indication contraire. GraphPad Prism (version 8.4.3) a été utilisé pour collecter et analyser les données. Des tests t de Student non appariés ont été utilisés pour comparer les moyennes de deux groupes. Une analyse de variance (ANOVA) unidirectionnelle (pour une variable indépendante) avec le test de comparaisons multiples de Tukey a été utilisée pour la comparaison entre les différents groupes sur toutes les combinaisons par paires. Les notations suivantes ont été utilisées dans les figures : *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 ; ns : non significatif.

Les cellules cancéreuses nécessitent une variété d'événements de reprogrammation métabolique pour soutenir leur survie et leur prolifération rapide. Ces voies pro-survie offrent des opportunités pour concevoir de nouvelles stratégies de thérapies ciblées. Pour déterminer la base métabolique de l'alkaliptose, nous nous sommes concentrés sur la glycolyse et le métabolisme à un carbone, qui partagent des facteurs régulateurs pour la croissance des cellules tumorales16. Après avoir analysé les résultats de la micropuce à ADN des cellules PDAC humaines (MiaPaCa2, PANC1 et CFPAC1) traitées avec JTC801, ACSS2 et le domaine hexokinase contenant 1 (HKDC1), il y avait des gènes régulés à la hausse de la glycolyse et du métabolisme à un carbone dans toutes les lignées cellulaires (Fig. 1A ). Une analyse qPCR ultérieure a confirmé que l'ARNm ACSS2 était régulé positivement dans les cellules MiaPaCa2 et PANC1 après le traitement JTC801 (Fig. 1B). Étant donné que ACSS2 est principalement impliqué dans le métabolisme des lipides, nous avons également utilisé la qPCR pour examiner les gènes clés du métabolisme des lipides. D'autres gènes liés au métabolisme des lipides, tels que ceux de l'ACSS1, de la synthase d'acide gras (FASN), de MYC, de la pyruvate déshydrogénase kinase 1 (PDK1) et de l'hexokinase 2 (HK2) ainsi que du gradient antérieur 2, membre de la famille des protéines disulfure isomérases (AGR2 ) ont également été régulés positivement à des degrés divers dans les cellules PANC1 ou MiaPaCa2 (Fig. 1C). De plus, une analyse par Western blot a montré que JTC801 induisait la régulation à la hausse de la protéine ACSS2 dans les cellules MiaPaCa2 et PANC1 de manière dépendante de la dose et du temps (Fig. 1D, E). En revanche, le niveau de protéine d'ACSS2 n'a pas été régulé positivement dans les cellules PANC1 par la staurosporine (un inducteur d'apoptose) (Fig. 1F). Ensemble, ces résultats indiquent que ACSS2 est régulé positivement pendant l'alkaliptose plutôt que l'apoptose.

ACSS2 est régulé positivement pendant l'alkaliptose. (A) Nous avons analysé les gènes régulés à la hausse impliqués dans le métabolisme du glucose et le métabolisme du carbone dans les cellules cancéreuses du pancréas (MiaPaCa2, PANC1 et CFPAC-1) à partir d'études de puces à ADN après que les cellules aient été traitées avec JTC801 (3 μM) pendant 24 h. (B) Analyse qPCR de l'ARNm de ACSS2 et HKDC1 dans des cellules MiaPaCa2 et PANC1 traitées avec JTC801 (3 μM) pendant 24 h (n = 3 échantillons biologiquement indépendants). (C) Analyse qPCR de l'ARNm de ACSS1, ACSS2, FASN, MYC, AGR2, PDK1 et HK2 dans des cellules MiaPaCa2 et PANC1 traitées avec JTC801 (3 μM) pendant 24 h. (D) Analyse Western blot de l'expression de la protéine ACSS2 dans les cellules MiaPaCa2 et PANC1 après traitement avec JTC801 indiqué pendant 24 h. La membrane a été coupée et sondée pour les anticorps indiqués. Les résultats quantitatifs sont tracés dans le panneau de droite. (n = 3 échantillons biologiquement indépendants, test t non apparié). (E) Analyse Western blot de l'expression de la protéine ACSS2 dans les cellules MiaPaCa2 et PANC1 après traitement avec JTC801 (3 μM) pendant 6 à 24 h (n = 3 échantillons biologiquement indépendants, test t non apparié). La bêta-actine a été sondée comme contrôle de chargement. Les résultats quantitatifs sont tracés dans le panneau de droite. (F) Analyse par Western blot de l'expression de la protéine indiquée dans les cellules MiaPaCa2 et PANC1 après traitement avec JTC801 (3 μM) ou staurosporine (500 nM) pendant 24 h. La membrane de PARP a été décapée et resondée pour ACSS2. La membrane a été incubée dans une solution de reblot pendant 30 min et bloquée pendant 30 min à température ambiante avec du lait cutané contenant du TBST (5 %) et sondée pendant une nuit à 4 °C avec anti-ACSS2 (Restore™ PLUS Western Blot Stripping Buffer, 46430, Thermo Scientific). Les résultats quantitatifs sont tracés dans le panneau de droite.

Pour déterminer si l'ACSS2 régulé positivement est impliqué dans l'alkaliptose, nous avons utilisé deux shARN spécifiques pour générer des cellules PDAC ACSS2-knockdown. Le transfert Western a confirmé que dans les cellules ACSS2-knockdown MiaPaCa2 et PANC1, le niveau de protéine d'ACSS2 était inhibé de plus de 70% (Fig. 2A). Par rapport au groupe témoin, la prolifération cellulaire des cellules ACSS2-knockdown MiaPaCa2 et PANC1 a été inhibée à 72 h (Fig. 2B), confirmant la découverte précédente selon laquelle ACSS2 est un facteur de prolifération. De manière significative, l'inactivation d'ACSS2 a inhibé l'inhibition de la croissance induite par JTC801 dans les cellules MiaPaCa2 et PANC1 à 24 h (Fig. 2C), mettant en évidence un rôle de mort pro-cellulaire différent d'ACSS2 en réponse à JTC801. Conformément au test de viabilité cellulaire à court terme, le test de clonage cellulaire à long terme a montré que, par rapport au groupe témoin, les cellules ACSS2-knockdown traitées avec JTC801 avaient une plus grande capacité de prolifération (Fig. 2D). L'utilisation de la coloration à l'iodure de propidium (PI) pour mesurer la rupture de la membrane plasmique a confirmé l'hypothèse selon laquelle ACSS2 est un régulateur positif de l'alkaliptose (Fig. 2E, Fig. S2). Conformément aux études précédentes11,12, les cellules ACSS2-knockdown étaient résistantes à l'apoptose induite par la staurosporine, comme le montre une analyse Western blot de la poly (ADP-ribose) polymérase-1 (PARP1) clivée et une analyse cytométrique en flux de l'activité Caspase-3/7 (Fig. 2F,G). Ces données établissent un rôle différent d'ACSS2 dans la promotion de l'alkaliptose induite par JTC801.

ACSS2 est un régulateur positif de l'alkaliptose. (A) Analyse Western blot de l'expression de la protéine ACSS2 dans les lignées cellulaires knockdown ACSS2 indiquées (n = 3 échantillons biologiquement indépendants). La membrane a été coupée et sondée pour les anticorps indiqués. Les résultats quantitatifs sont tracés dans le panneau de droite. (B) Analyse de la viabilité cellulaire dans les cellules indiquées à 24-72 h (n = 3 échantillons biologiquement indépendants). (C) Analyse de la viabilité cellulaire dans les cellules indiquées après traitement avec JTC801 (1 à 5 µM) pendant 24 h (n = 3 échantillons biologiquement indépendants). (D) Analyse de la formation de clonage cellulaire dans le contrôle indiqué ou les cellules PANC1 et MiaPaCa2 traitées au JTC801. Les résultats quantitatifs sont tracés dans le panneau inférieur. (E) Analyse de la mort cellulaire par coloration PI dans les cellules indiquées après traitement avec JTC801 (3 µM) pendant 24 h (n = 3 échantillons biologiquement indépendants). Barre = 200 µm. Les résultats quantitatifs sont tracés dans le panneau ci-dessous. (F) Analyse Western blot de l'expression des protéines ACSS2 et C-PARP dans les cellules indiquées après un traitement avec de la staurosporine (500 nM) ou JTC801 (3 µM) pendant 24 h (n = 3 échantillons biologiquement indépendants). La membrane a été coupée et sondée pour les anticorps indiqués. La membrane de PARP a été décapée et resondée pour ACSS2. La membrane a été incubée dans une solution de reblot pendant 30 min et bloquée pendant 30 min à température ambiante avec du lait cutané contenant du TBST (5 %) et sondée pendant une nuit à 4 °C avec anti-ACSS2 (Restore™ PLUS Western Blot Stripping Buffer, 46430, Thermo Scientific). (G) Analyse cytométrique en flux de l'activité Caspase 3/7 dans les cellules indiquées après traitement avec de la staurosporine (500 nM) ou JTC801 (3 µM) pendant 24 h (n = 3 échantillons biologiquement indépendants).

Étant donné que l'augmentation du pH intracellulaire est un événement métabolique clé qui entraîne l'alkaliptose4, nous avons utilisé une sonde fluorescente de pH conçue pour détecter le pH intracellulaire. Comme prévu, JTC801 a augmenté le pH intracellulaire dans les cellules MiaPaCa2 et PANC1 (Fig. 3A). En revanche, la suppression de l'expression de ACSS2 a bloqué de manière significative la régulation à la hausse du pH intracellulaire induite par JTC801 (Fig. 3A). En tant que contrôle précis, le pH extracellulaire mesuré par une bandelette de test de pH n'a pas été affecté par JTC801 dans les cellules témoins et ACSS2-knockdown MiaPaCa2 et PANC1 (Fig. 3B). Ces résultats suggèrent que l'ACSS2 favorise l'alkaliptose par la régulation à la hausse du pH intracellulaire plutôt que du pH extracellulaire.

L'acétylation des histones médiée par ACSS2 inhibe l'acidification du cytoplasme dans l'alkaliptose. (A, B) Les valeurs de pH intracellulaire et extracellulaire ont été détectées dans les cellules MiaPaCa2 et PANC1 indiquées après traitement avec JTC801 (3 μM) pendant 24 h (n = 3 échantillons biologiquement indépendants). (C) Analyse ELISA des niveaux d'acétyl-CoA dans les cellules MiaPaCa2 et PANC1 indiquées après traitement avec JTC801 (3 μM) pendant 24 h (n = 3 échantillons biologiquement indépendants). (D) Les valeurs de pH intracellulaires ont été détectées dans les cellules MiaPaCa2 et PANC1 indiquées après traitement avec JTC801 (3 μM) et trichostatine (TSA; 200 nM) pendant 24 h (n = 3 échantillons biologiquement indépendants). (E) Les valeurs de pH extracellulaires ont été détectées dans les cellules MiaPaCa2 et PANC1 indiquées après traitement avec JTC801 (3 μM) et trichostatine (TSA; 200 nM) pendant 24 h (n = 3 échantillons biologiquement indépendants).

Pour mieux définir le rôle d'ACSS2 dans l'alkaliptose, nous avons dosé le niveau intracellulaire d'AcCoA. JTC801 a induit la régulation à la hausse de l'AcCoA intracellulaire dans les cellules témoins, mais pas dans les cellules ACSS2-knockdown MiaPaCa2 et PANC1 (Fig. 3C). La trichostatine A (TSA), un large inhibiteur de la désacétylase qui peut améliorer l'acétylation des histones, n'a pas réussi à induire une régulation positive du pH intracellulaire ou extracellulaire dans les cellules de type sauvage et ACSS2-knockdown (Fig. 3D, E). Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que ACSS2 médie la production d'AcCoA et la régulation à la hausse du pH intracellulaire au cours de l'alkaliptose induite par JTC801.

L'une des fonctions importantes de la production d'AcCoA médiée par ACSS2 est de réguler la transcription des gènes par l'acétylation des histones10. Étant donné que l'activation de NF-κB est un événement de signalisation important qui entraîne l'alkaliptose4, nous avons ensuite examiné la relation entre l'acétylation des histones et la voie NF-κB dans les cellules de type sauvage et ACSS2-knockdown en réponse à JTC801.

Le complexe IKK kinase est composé de deux kinases (IKKα et IKKβ) et d'une sous-unité régulatrice, NEMO/IKKγ, qui sont les éléments centraux de la cascade NF-κB18. IKK phosphoryle la protéine IκBα, conduisant à l'ubiquitination subséquente de IκBα, qui est finalement dégradée par le protéasome18. Après que IκBα se dissocie de NF-κB (RelA et p50), NF-κB activé est transféré du cytoplasme au noyau, où il commence à initier la transcription génique18. Nos résultats de Western blot ont montré que JTC801 régule à la hausse l'expression protéique de la lysine acétylée par l'histone (AC-K2-100) (Fig. S3C et Fig. 3D) et les composants centraux de la voie NF-κB (IKKα, IKKβ et NF- κB) dans les cellules MiaPaCa2 (Fig. 4A, B), et le test de viabilité cellulaire a montré que l'acétate augmentait la sensibilité des cellules MiaPaCa2 et PANC1 à JTC801 (Fig. S4). En revanche, l'inactivation d'ACSS2 a inversé ce processus et a été associée à une réduction des événements de phosphorylation de NF-κB et à une augmentation de l'expression de CA9 (Fig. 4A, B). Nos expériences de coIP démontrent le niveau d'acétylation de NF-κB dans des lignées cellulaires avec knockdown d'ACSS2 (Fig. 4C). Nous avons également détecté le niveau d'acétylation et l'expression de CA9 après l'inactivation d'ACSS2 par western blot (Fig. S3A et S3B). Ces résultats indiquent qu'ACSS2 soutient la régulation négative de CA9 médiée par NF-κB pendant l'alkaliptose induite par JTC801. En tant que contrôle positif, CA9 a été régulé positivement pendant l'hypoxie induite par CoCl2 (Fig. S5).

L'acétylation des histones médiée par ACSS2 favorise l'alkaliptose. (A, B) Analyse Western blot de l'expression de la protéine indiquée dans les lignées cellulaires témoins ou ACSS2 knockdown après traitement avec JTC801 (3 μM) pendant 24 h (n = 3 échantillons biologiquement indépendants). Les résultats représentatifs de Western blot sont présentés dans le panneau de gauche. La membrane a été coupée et sondée pour les anticorps indiqués. La membrane de p-IKKα/β a été décapée et sondée à nouveau pour IKKα et IKKβ. La membrane a été incubée dans une solution de reblot pendant 30 min et bloquée pendant 30 min à température ambiante avec du lait pour la peau contenant du TBST (5%) et sondée pendant une nuit à 4 ° C avec anti-IKKα. Répétez les étapes ci-dessus pour resonder la membrane avec l'anticorps anti-IKKβ. La membrane de p-NFκB a été décapée et resondée pour ACSS2. La membrane de p-IκBα a été décapée et sondée à nouveau pour IκBα et GAPDH. L'expression protéique de CA9 a été mesurée dans les lignées cellulaires indiquées après traitement avec JTC801 (3 μM) pendant 24 h sous 5 % de CO2 et normoxie. Les résultats quantitatifs sont tracés dans le panneau de droite. (C) Contrôle ou knockdown ACSS2 dans les cellules MIAPaCa2 et PANC1. Les lysats cellulaires ont été extraits pour la coIP, les immunoprécipités ont été analysés à l'aide des anticorps indiqués et du Western blot représentatif indiqué dans le panneau de gauche. La membrane d'Ac-lys a été décapée et resondée pour NFκB. (D) Les lignées cellulaires témoins ou ACSS2 knockdown ont été traitées avec JTC801 (1–5 μM) en l'absence ou en présence de trichostatine (TSA, 200 nM) pendant 24 h, puis la viabilité cellulaire a été testée (n = 3 échantillons biologiquement indépendants) . (E) Diagramme schématique du rôle de ACSS2 dans l'alkaliptose induite par JTC801.

Nous avons ensuite examiné si la TSA pouvait inverser l'effet inhibiteur de l'alkaliptose dans les cellules MiaPaCa2 knock-down ACSS2. Un test de viabilité cellulaire a montré que la TSA rétablissait la sensibilité des cellules MiaPaCa2 knock-down ACSS2 à JTC801 (Fig. 4D). En revanche, la synergie de TSA et de JTC801 dans les cellules de type sauvage était faible (Fig. 4D).

Le PDAC est actuellement le cancer le plus meurtrier du système digestif, avec un taux de survie global à 5 ​​ans d'environ 10 %. Par rapport à la chimiothérapie actuelle qui induit l'apoptose, les RCD non apoptotiques (y compris l'alkaliptose) offrent de nouvelles opportunités pour le traitement de la PDAC19. Dans cette étude, nous avons démontré qu'ACSS2 est un nouveau régulateur de l'alkaliptose en activant la voie NF-κB dans les cellules PDAC humaines (Fig. 4E). Alors que ACSS2 peut médier la résistance à l'apoptose, il est régulé positivement pendant l'alkaliptose induite par JTC801 dans les cellules PDAC. Ces résultats confirment que ACSS2 joue un double rôle dans la mort cellulaire, en fonction du stimulus. L'induction de l'alkaliptose peut être une méthode intéressante pour le traitement de la PDAC avec une expression ACSS2 élevée.

Par rapport à ACSS1 et ACSS3 spécifiques aux tissus, l'expression de ACSS2 est répandue dans différents tissus20. Des études précliniques ont montré que l'ACSS2 peut utiliser l'acétate pour médier l'acétylation des histones, qui joue un rôle clé dans la régulation de l'expression des gènes, la croissance cellulaire et le développement du cancer9,10. Dans la présente étude, nous avons démontré que l'alkaliptose induite par JTC801 nécessite cette voie d'acétylation des histones dépendante de l'ACSS2. Bien que les modifications génétiques globales de l'alkaliptose induite par JTC801 doivent encore être étudiées à l'avenir, nous avons constaté que l'expression et l'activation de la voie NF-κB sont altérées dans les cellules PDAC knock-down ACSS2. Comme ACSS2, NF-κB est généralement un facteur pro-survie qui inhibe l'apoptose. Cependant, l'alkaliptose repose en partie sur l'activation de NF-κB pour inhiber l'expression de CA9, entraînant une augmentation du pH4 intracellulaire. L'augmentation du pH intracellulaire peut encore accélérer l'acétylation globale des histones, qui dépend des transporteurs d'acides monocarboxyliques21. Dans l'ensemble, ces résultats établissent une stratégie potentielle pour l'utilisation de signaux ou de voies pro-survie pour déclencher la mort cellulaire dans les cellules PDAC.

En plus de la médiation de la régulation épigénétique de la transcription des gènes par l'acétylation des histones, une autre fonction importante de la famille ACSS, y compris ACSS2, dans la biologie tumorale est de médier la synthèse des acides gras pour la croissance tumorale6. La synthèse des acides gras est la production d'acides gras à partir d'AcCoA et de NADPH par FASN. Néanmoins, la synthèse excessive d'acides gras joue également un rôle dans la médiation de la mort cellulaire en activant la ferroptose dépendante de la peroxydation lipidique. En particulier, la voie de biosynthèse des acides gras polyinsaturés joue un rôle essentiel dans la ferroptose22. Cependant, les premières études ont montré que les inhibiteurs de la ferroptose, tels que la ferrostatine-1, ne peuvent pas inhiber la mort cellulaire induite par le JTC8014. Par conséquent, bien que différents différentiels puissent partager certains signaux, leurs effecteurs et leurs mécanismes de rétroaction sont différents.

L'alkaliptose est généralement un type de nécrose régulée avec une rupture de la membrane plasmique et la libération de motifs moléculaires associés aux dommages (DAMP). La boîte de groupe à haute mobilité 1 (HMGB1) est un DAMP nucléaire représentatif dans une variété de RCD, qui peut déclencher diverses réponses immunitaires. Par exemple, HMGB1 peut être libéré par les cellules cancéreuses en réponse à la chimiothérapie ou à la radiothérapie pour activer les cellules présentatrices d'antigène environnantes afin d'obtenir une immunité antitumorale23. Nous avons récemment observé que HMGB1 est un médiateur de la réponse inflammatoire causée par une lésion alkaliptosique24. En plus de la libération passive, la sécrétion active de HMGB1 dans l'espace extracellulaire nécessite l'acétylation de HMGB125. Il est important d'examiner plus avant si l'acétylation et la libération de HMGB1 dépendent de la régulation à la hausse d'ACCS2 dans l'alkaliptose, ce qui peut favoriser le développement d'immunothérapies pour PDAC.

En résumé, nous avons démontré qu'ACCS2 est un nouveau régulateur de l'alkaliptose en activant l'acétylation des histones. Ces résultats soulignent l'importance potentielle d'ACCS2 en tant que biomarqueur et contributeur au traitement médié par l'alkaliptose5.

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Nous remercions Dave Primm (Département de chirurgie, University of Texas Southwestern Medical Center) pour sa lecture critique du manuscrit.

Le laboratoire DAMP, troisième hôpital affilié de l'université médicale de Guangzhou, Guangzhou, 510120, Guangdong, Chine

Dongwen Que, Feimei Kuang et Jiao Liu

Département de chirurgie, UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, États-Unis

Rui Kang et Daolin Tang

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DT et JL ont conçu et planifié les expériences. DQ, FK et JL ont effectué les simulations et la préparation des échantillons, et ont analysé les données. DQ et DT ont rédigé l'article. RK a aidé à l'interprétation des données et a édité le manuscrit. Tous les auteurs ont fourni des commentaires critiques et ont contribué à façonner la recherche, l'analyse et le manuscrit.

Correspondance à Daolin Tang ou Jiao Liu.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Que , D. , Kuang , F. , Kang , R. et al. L'activation de NF-κB médiée par ACSS2 favorise l'alkaliptose dans les cellules cancéreuses pancréatiques humaines. Sci Rep 13, 1483 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28261-4

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Reçu : 17 mai 2022

Accepté : 16 janvier 2023

Publié: 27 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-28261-4

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